El estudio se llevó a cabo en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Juárez del Estado de Durango. El nopal forrajero variedad AV6 fue cosechado al azar de una nopalera cultivada, localizada a un costado de la Facultad y dentro del municipio de Durango, Durango, México.

Las pencas de nopal fueron cortadas en piezas de aproximadamente 1 cm² utilizando un cuchillo de acero inoxidable y colocadas en contenedores de plástico de 19 l, en donde fueron inoculadas con Sacharomyces cerevisiae (1% m/m). El proceso de fermentación fue llevado a cabo por 48 h a 25ºC. Los tratamientos consistieron en incluir nopal y nopal fermentado a forraje de maíz, como se muestra en la tabla 1. Microsilos experimentales fueron preparados con forraje de maíz picado sin grano, y en estado maduro con un tamaño de partícula de 2 a 4 cm (Variedad: hibrído 21/20) (T1, n=7), rastrojo de maíz con nopal fresco (T2, n=7) y rastrojo de maíz con nopal fermentado (T3, n=7) en contenedores de plástico (30 cm diámetro × 50 cm alto), sellados herméticamente por 30 d. Después de este tiempo, los microsilos fueron abiertos para su posterior análisis.

Tabla 1

(%)	T1	T2	T3
Ingredientes
Rastrojo de maíz	100	75	75
Nopal sin fermentar	--	25	--
Nopal fermentado	--	--	25

Una vez que fueron abiertos los microsilos se evaluaron las siguientes variables: pH (Hanna instruments, modelo HI 83142); ácido láctico de acuerdo con Borshchevskaya et al. (2016); así como los contenidos de ácidos grasos volátiles y nitrógeno amoniacal (NH3-N), empleando los procedimientos propuestos por Galyean (2010).

Las muestras de cada microsilo experimental fueron secadas en una estufa de aire forzado a 55 °C por 72 h; posteriormente se redujo el tamaño de partícula a 1 mm en un molino Wileymil (Arthur H Thomas, Philadelphia, PA, USA), para determinar los contenidos de material seca (MS) (método 934.01). La concentración de proteína cruda (PC) fueron determinadas por la técnica de micro-Kjeldhal (método 920.87),utilizando el factor de conversión (6.25) (AOAC, 2010). La concentración de FDN, FDA fueron obtenidas de acuerdo a los procedimientos propuestos por Van Soest (1991) y los parámetros de producción de gas de acuerdo a la técnica descrita por Menke y Steingass (1988).

Aproximadamente 1 g de muestra de cada microsilo experimental fue colocado en módulos de vidrio en un equipo transductor de presión marca ANKOM e incubados por triplicado con una solución 2:1 de solución buffer-líquido ruminal, de acuerdo al procedimiento descrito por Murillo-Ortiz et al. (2018). Las incubaciones fueron llevadas a cabo desde las 0 hasta las 96 h y registrando los valores de presión al mismo tiempo.

La cinética de producción de gas fue estimada mediante la función de Gompertz (Murillo- Ortiz et al., 2018), de acuerdo a la siguiente ecuación:

GP =Gmax ∗ exp[−A ∗ exp(−k ∗ t)]

Donde GP= producción de gas al tiempo t (ml), Gmax= producción máxima de gas (ml), k= tasa constante de producción de gas (h^-1) y A= fase lag (h). De la incubación de las 24 h, se abrió la válvula para liberar gas durante 2 s de cada módulo. El gas liberado de cada módulo se conectó a un analizador portátil de CH₄ y CO₂ a través de un tubo para medir la concentración de estos gases de acuerdo a los procedimientos establecidos por el fabricante (GEM^TM5000, LANDTEC, USA).

Para evaluar los parámetros de fermentación, se colocó 1 g de muestra en bolsas de nylon (ANKOM, F500 nylon bags; ANKOM, 2018), pesadas previamente y colocadas dentro de los módulos ANKOM e incubadas por triplicado con solución buffer:líquido ruminal, en una relación 2:1 de acuerdo con Murillo-Ortiz et al. (2018). Después de 24 h de fermentación continua, los módulos fueron abiertos e inmediatamente se midió el pH (Hanna instruments, model HI 83142). Las bolsas se sacaron de los módulos y se lavaron con agua destilada y secadas a 65°C por 48 h. La digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) se calculó en base a la diferencia en el contenido de materia seca del sustrato antes y después de la incubación. Adicionalmente y aproximadamente 1.0 ml del filtrado fueron centrifugados a 3,000×g por 5 min; luego, 500 μl del líquido sobrenadante fue acidificado con 150 μl de ácido meta fosfórico al 25 % para evaluar ácidos grasos volátiles. También aproximadamente 1.0 ml del filtrado fue colocado en tubos y acidificado con 30 μl de ácido sulfúrico al 50 % v/v para determinar N-NH3 (Galyean, 2010).

Los datos obtenidos fueron analizados con un diseño completamente al azar, utilizando los procedimientos GLM de SAS (2010). Las medias fueron comparadas con la prueba de rango múltiple de Tukey y declarando diferencias significativas cuando fue P≤0.05.

El contenido de materia seca (MS) disminuyó con la inclusión de rastrojo de maíz (P<0.05, tabla 2). Los ensilados que contienen rastrojo y nopal (t2 y t3) presentaron contenidos de MS adecuados, ya que de acuerdo con Pineda-Cordero (2016) los ensilados que contienen entre el 30 y 35 % de MS se consideran de buena calidad.

Además, la humedad presente en los ensilados determina el tipo de fermentación que se realizó durante el proceso de ensilado. Otros factores que determinan la calidad de la fermentación son los carbohidratos solubles presentes y la capacidad amortiguadora del forraje empleado (Bernal et al., 2002).

La concentración de proteína cruda (PC) fue diferente entre tratamientos (P<0.05, tabla 2). La adición de nopal y nopal fermentado aumentó 43.54 % y 79 % la concentración de PC en los ensilados respectivamente, comparados con t1. Los incrementos en t2 y t3 se deben al contenido de proteína inicial en el rastrojo de maíz antes de ser ensilado (el forraje verde maduro contenía 4.9 %, mientras que el rastrojo contenía 5.2 % de PC; resultados no mostrados) y a la proliferación de proteína celular proveniente de la levadura Saccharomyces cereviseae empleada para fermentar el nopal. No obstante, Alhanafi et al. (2019) registraron un menor contenido de PC en ensilados de Opuntia ficus, indica adicionado con Atriplex (6.41 %); en comparación con t2 de este estudio.

Tabla 2

(%)	T1	T2	T3	EEM
Materia seca	42.0±0.29 a	35.9±0.48b	35.5±0.26b	0.25
Proteína cruda	6.2±0.55c	8.9±0.10b	11.1±0.05a	0.05
Fibra detergente neutro	53.2±2.31b	63.1±0.08a	58.8±0.12ab	1.09
Fibra detergente ácida	23.6±0.06c	37.6±0.05a	35.3±0.73b	0.34
Digestibilidad de la materia seca	61.8±2.44	58.4±1.98	64.1±2.20	1.81

^a,b Letras diferentes en la misma fila indican diferencias (P<0.05). EEM=error estándar de la media, n=3.

La concentración de fibra detergente neutro (FDN) fue menor en el T1 (P<0.05, tabla 2); se observó un incremento de 18 % en t2. Este aumento se debe a la presencia del rastrojo de maíz, el cual posee una alta cantidad de fibra; sin embargo, parte de la hemicelulosa es hidrolizada durante el proceso de ensilado. En esta etapa las pentosas se liberan y se fermentan en ácido láctico y ácido acético (McDonald et al., 2002).

Igualmente, el contenido de fibra detergente ácida (FDA) mostró el mismo comportamiento; FDA aumentó 59 y 49 % en T2 y T3, respectivamente (P<0.05, Tabla 2). De la misma manera, los incrementos en FDA se le atribuyen a la presencia de rastrojo de maíz en t2 y t3. No obstante, los contenidos de FDN y FDA se encuentran dentro del rango de forrajes de buena calidad.

Los valores de pH fueron mayores en t2 y t3, con respecto a t1 (P<0.05, tabla 3); sin embargo, todos se encuentran en los valores ideales, lo cual es indicativo de un buen proceso de fermentación y conservación. Cabe mencionar que la velocidad con la que un ensilado logra un pH <4.0 garantiza la estabilidad del mismo y reduce la pérdida de nutrientes por fermentaciones secundarias, o bien por contaminación de bacterias y hongos (Ha Vu et al., 2019).

La concentración de nitrógeno amoniacal en los ensilados se incrementó con la inclusión de nopal y nopal fermentado (P<0.05, tabla 3). Este incremento registrado en los ensilados del t2 y t3 pudo haber sido ocasionado por un aumento en los microorganismos que degradan proteína (Berumen et al., 2015; Ruangyote y Metha, 2018), o también el empleo de rastrojo de maíz reduce la cantidad de carbohidratos solubles y por lo tanto aumenta la degradación de proteínas (Herremans et al., 2019). Sin embargo, para clasificar un ensilado como de buena calidad, la concentración de nitrógeno amoniacal máxima debe ser de 7-20 % del nitrógeno total (Sánchez y García, 2017); por lo cual los ensilados experimentales obtuvieron valores que se encuentran dentro de este rango y por lo tanto indican que se llevó a cabo un adecuado proceso de fermentación.

Tabla 3

	T1	T2	T3	EEM
pH	4.3±0.05b	4.7±0.04a	4.7±0.01a	0.03
N-NH3 (g/kg MS)	1.9±0.09c	5.5±0.09b	6.5±0.20a	0.03
Ácido Láctico (g/kg MS)	24.3±3.45b	73.9±1.91a	76.7±4.18a	2.71
Ácido Acético (% MS)	0.7±0.26c	0.9±0.00b	1.1±0.02a	0.01
Ácido Propiónico (% MS)	3.5±0.01c	4.2±0.02b	4.3±0.01a	0.01
Ácido Butírico (% MS)	0.01±0.002b	0.03±0.004a	0.04±0.001a	0.002

^a,b Letras diferentes en la misma fila indican diferencias (P<0.05). EEM=error estándar de la media. N-NH3 =nitrógeno amoniacal, n=3.

La concentración de ácido acético fue diferente entre tratamientos (P<0.05, tabla 3). Los ácidos grasos volátiles son producto de fermentaciones inducidas por la presencia de bacterias coliformes que transforman el ácido láctico en acético y butírico, y que están presentes en el estiércol y la tierra. De acuerdo con Kung et al. (2018), las concentraciones de ácido acético se encuentran entre 0.5 y 2.0%, cuando el contenido de MS es de 45 a 55 %; por lo que los valores obtenidos en este trabajo se encuentran dentro del rango para ensilados de buena calidad (0.5-1.1 %). Los valores de ácido propiónico fueron diferentes entre tratamientos (P<0.05, tabla 4). Los resultados obtenidos en este estudio son iguales a los reportados por González et al., (2019) en ensilado de maíz con nopal y nopal fermentado (4.0 %). Las concentraciones de ácido butírico fueron mayores en los ensilados que contienen rastrojo (P<0.05, tabla 3); sin embargo, estos valores indican que hubo una adecuada fermentación. Además, Da Silva et al. (2020) reporta valores más bajos de ácido propiónico en ensilados de nopal con gliricidia. De acuerdo a los valores obtenidos de ácido láctico y butírico en los ensilados de este estudio, se puede inferir que la inclusión de nopal y nopal fermentado en el rastrojo promueve un incremento en el ácido láctico y una disminución en el butírico, lo cual da como resultado ensilados con buena calidad fermentativa y nutrimental.

La concentración de N-NH₃ fue menor en t1, comparado con t2 y t3 (P<0.05, tabla 4). La inclusión de nopal y nopal fermentado en los ensilados de rastrojo promovió un incremento de 48 % y 27.7 % en N-NH₃, respectivamente. Cambios en esta variable indican que se está llevando una proteólisis y la cual se incrementó debido al incremento en la proteína cruda en el ensilado por la adición de rastrojo y nopal fermentado. No obstante, hay estudios que afirman que incrementos en la concentración de N-NH₃ se deben a que la proteína no es incorporada a la síntesis de proteína microbiana, lo cual reflejaría una pérdida de energía en el rumiante (Rodríguez et al., 2007). Por el contrario, otros autores también encontraron incrementos en la cantidad de N-NH₃ cuando se incrementó el contenido de proteína cruda a través de la adición de urea en ensilados de piña (López-Herrera et al., 2014). Adicionalmente, estos resultados coinciden con los obtenidos por Pinho et al. (2017) en ensilados de nopal (17 mg/dL) a las 9 horas de incubación. De tal manera, en este estudio las concentraciones de N-NH₃ registradas en todos los tratamientos presentaron niveles adecuados mayores a 5 mg/dL, lo que permite garantizar la síntesis de proteína microbiana (Rodríguez et al., 2007).

Tabla 4

	T1	T2	T3	EEM
pH	6.8±0.008	6.9±0.17	6.9±0.03	0.01
N-NH3 (mg/dL)	11.9±1.08b	17.7±0.43a	15.2±0.08a	0.55
Ácido Acético (%)	53.3±0.89a	52.1±0.48a	46.5±0.43b	0.52
Ácido Propiónico (%)	27.1±0.72b	30.6±0.31a	32.1±0.45a	0.43
Ácido Butírico (%)	14.7±0.05a	12.6±0.13b	14.7±0.05a	0.07

^a,b

Letras diferentes en la misma fila indican diferencias (P<0.05). EEM=error estándar de la media. N-NH3 nitrógeno amoniacal; n=3.

Por otro lado, la concentración de ácido acético disminuyó y la de propionato se incrementó en los ensilados de rastrojo de maíz y nopal fermentado (P<0.05; tabla 4), en comparación con t1 y t2. En este sentido, un decremento en la concentración de ácido acético en t2 y t3, se encuentra estrechamente relacionado con una disminución en la fermentación de carbohidratos estructurales (FDN y FDA). De esta manera, al ser los carbohidratos estructurales los de mayor concentración en los nutrientes de t2 y t3, se sugiere que no se está llevando una fermentación adecuada (Van Soest, 1994). Sin embargo, Sánchez et al. (2014) también detectaron una disminución en la concentración de acetato y un incremento en el propionato ruminal. Regularmente, la tasa de producción de propionato y otros AGV está directamente relacionada con el consumo de sustratos fermentables de la dieta, lo que favorece la síntesis de propionato a partir de la fermentación microbiana por las bacterias amilolíticas (Van Soest, 1994).

La máxima producción de gas (Gmax) fue mayor en t1 (P<0.05; tabla 5). La inclusión de nopal y nopal fermentado en ensilados con rastrojo de maíz disminuyó la máxima producción de gas 31.9 % y 48.7 %, respectivamente. Los valores obtenidos en este estudio son menores a los reportados en leucaena y pasto estrella (234 y 154 ml/g, respectivamente) por Naranjo et al. (2016). De igual forma, González et al. (2019) registraron valores de Gmax mayores en ensilados de maíz con nopal (176 ml). La disminución en la producción de gas observada en este estudio se le atribuye a la disminución de la digestibilidad de la materia seca en t2 y t3, como resultado de la adición de rastrojo de maíz, cuyos valores de FDN y FDA son más altos que los registrados en t1. Así como se expresó anteriormente, la presencia de carbohidratos estructurales impiden que se lleve una fermentación adecuada, lo cual se ve reflejado en la producción de gas.

Tabla 5

Parámetro	T1	T2	T3	EEM
Gmax (ml/g MS)	124.8±8.48a	94.6±6.50b	84.0±1.75b	5.10
A (h)	4.2±0.21a	2.7±0.03b	4.4±0.04a	0.10
K(%/h)	0.08±0.001	0.07±0.007	0.09±0.003	0.003
Metano (ml/g MS)	9.7±0.29a	7.3±0.29b	6.5±0.16b	0.21
CO2 (ml/g MS)	59.0±4.49a	49.8±0.75ab	44.7±0.70b	2.17
Relación metano:CO2	0.16±0.010 a	0.14±0.003 b	0.14±0.005 b	0.014

^{a, b}

Letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa (P<0.05). EEM=error estándar de la media; Gmax: producción máxima de gas; k representa la tasa específica de producción de gas; A es el periodo de latencia antes de que inicie la producción de gas (fase lag).

Por su lado, el periodo de latencia “A” disminuyó 55 % en el t2 (ensilado de rastrojo + nopal). Para explicar este resultado se deben tomar en cuenta variables que no fueron consideradas en este estudio, como el contenido de carbohidratos solubles o la lignina; ya que de estos depende que el inicio de la fermentación sea más rápido. En este sentido, López-Inzunza et al. (2017) reportaron mayores tiempos de latencia para ensilados con mayor contenido de FDA, con respecto al contenido de FDN en ensilados con rastrojo de piña; estos autores mostraron concentraciones de carbohidratos estructurales y tiempos de latencia similares a los reportados en este estudio (72 % de FDN y una A de 3.8 h).

Además, los valores de A obtenidos en este estudio también son similares a los registrados por González et al. (2019) en ensilados de forraje de maíz con nopal. Adicionalmente, la producción de metano disminuyó 32 y 49 % en los ensilados que incluyeron nopal y nopal fermentado, respectivamente (P<0.05; tabla 5). De la misma manera, la relación metano:CO₂ también disminuyó con la adición de nopal y nopal fermentado, así como de rastrojo de maíz. Esta variable está estrechamente relacionada con la síntesis de metano ruminal. Mayores valores en esta relación sugiere un incremento en la síntesis de metano ruminal a través de la ruta de la reducción de CO₂ (Murillo et al., 2018). De esta manera, aunque una reducción en la producción de metano y CO₂ están estrechamente relacionados con una disminución en la calidad fermentativa de los ensilados t2 y t3, esta reducción también sugiere cambios o incluso una inhibición en las poblaciones metanogénicas (Tavendale et al., 2005). Además, la disminución de metano está directamente relacionada con un aumento en la producción de propionato ruminal, tal y como lo muestra el presente estudio.