av Abanico veterinario Abanico vet 2007-428X 2448-6132 Sergio Martínez González 10.21929/abavet2021.12 00108 Artículo Original Criopreservación espermática de Ambystoma mexicanum (Shaw & Nodder, 1798) 0000-0002-9091-9218 Rivera-Pacheco Juan 1 0000-0003-1492-2228 Herrera-Barragán José 2 * 0000-0003-2899-9998 León-Galván Miguel 3 0000-0003-0158-5832 Ocampo-Cervantes José 4 0000-0003-1078-6695 Pérez-Rivero Juan 2 0000-0002-3956-4415 Gual-Sill Fernando 2 Maestría en Biología de la reproducción animal; Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa CDMX, CP, 09340. Universidad Autónoma Metropolitana Universidad Autónoma Metropolitana CDMX Mexico Departamento de Producción Agrícola y Animal; Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X), Calzada del hueso 1100, Coyoacán CDMX, CP. 04960. Universidad Autónoma Metropolitana Universidad Autónoma Metropolitana CDMX Mexico Departamento de Biología., Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa CDMX, CP, 09340. Universidad Autónoma Metropolitana Departamento de Biología Universidad Autónoma Metropolitana CDMX Mexico Centro de Investigaciones Biológicas y Acuícolas de Cuemanco (CIBAC / UAM-X), Rinconada Cuemanco S/N, Xochimilco, CDMX; CP 16035. Universidad Autónoma Metropolitana UAM CDMX Mexico Autor para correspondencia: José Antonio Herrera Barragán, Departamento de Producción Agrícola y Animal. Edificio W, piso 3. Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco Calzada del hueso 1100, Coyoacán CDMX, CP. 04960. Correo electrónico: jherrerab@correo.xoc.uam.mx, jcripbiologia@gmail.com, leon@xanum.uam.mx, jocampo@correo.xoc.uam.mx, jjperez1_1999@yahoo.com, fguals@correo.xoc.uam.mx

Clave:2020-80.

 30 04 2021 Jan-Dec 2021 11 e108 20 09 2020 05 02 2021 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons Resumen:

El Ambystoma mexicanum se encuentra en peligro de extinción en vida libre, debido a efectos antropogénicos; la criopreservación espermática para su reproducción en cautiverio, puede ayudar a su conservación ex situ. El objetivo de esta investigación fue identificar la viabilidad en fresco y post descongelación de espermatozoides provenientes de diferentes espermatóforos. Durante la temporada reproductiva se indujo en nueve ejemplares, la liberación de espermatóforos mediante la reducción de la temperatura del agua. La concentración promedio por espermatóforo fue de 2.6 ± 0.6 X104 espermatozoides. Se determinó en espermatozoides en fresco y post descongelación, una reducción del 30% de espermatozoides vivos y un incremento de 15 % de morfología anormal. Con las lectinas WGA y PNA, unidas a FITC, se determinaron dos patrones de fluorescencia distintos con cada una, lo cual evidencio la presencia y distribución membranal de N-acetil glucosamina, ácido siálico y manosa respectivamente. Los porcentajes de espermatozoides con cada patrón de fluorescencia mostraron diferencias asociadas al número de espermatóforos de cada liberación. Se determinaron diferencias en la viabilidad de espermatozoides obtenidos de liberaciones con diferente número de espermatóforos. El protocolo para la obtención y criopreservación espermática de A mexicanum, fue eficiente como herramienta para utilizar semen criopreservado para su reproducción ex situ.

 Palabras clave: Anfibio conservación espermatóforo urodelo INTRODUCCIÓN

La disminución en las poblaciones de anfibios los han llevado en casos severos a la extinción, las principales causas son la contaminación o modificación de su hábitat, la introducción de especies exóticas invasoras y enfermedades (Catenazzi, 2015; Jiménez et al., 2017; Tietje y Rödel, 2018). Actualmente, La Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN, 2020), indican que más del 85% de las especies de anfibios de México se encuentran en alguna categoría de riesgo, debido a esta situación, la mayoría de las especies del género Ambystoma en vida silvestre, actualmente se ha optado por reproducirlos en condiciones de laboratorio (Mendoza, 2012; Khattak et al., 2014; Jiménez et al., 2017). De manera específica el Ambystoma mexicanum, está incluido en la NOM-059-SEMARNAT-2010 como especie en peligro de extinción (NOM-059-ECOL, 2010).

La reproducción ex situ utilizando semen criopreservado, es una herramienta de reproducción asistida en cautiverio que puede contribuir a la conservación del Ambystoma mexicanum; además de contribuir a incrementar su variabilidad genética, debido a que en la mayoría de los casos la amenaza se encuentra en su propio hábitat (Clulow et al., 2014; Jiménez et al., 2017). Sin embargo, antes de implementar un protocolo de criopreservación espermática, es necesario conocer la biología reproductiva y las características espermáticas de la especie, para lograr un mayor éxito (Chester, 2013; Silla y Byrne, 2019).

Actualmente, las técnicas de obtención de gametos (espermatozoides y óvulos) que se realizan en anfibios son altamente invasivas, pues la mayoría de los procesos requieren del sacrificio del ejemplar para la extracción de los testículos o conductos eferentes y proceder a macerarlos (Chester, 2013; Shishova et al., 2011). La mayoría de los protocolos de criopreservación utilizados en espermatozoides de diferentes especies, de anfibios, han sido extrapolados de los reportados en de peces (Comizzoli et al., 2012); mostrando resultados variables entre cada uno. Chester (2013) criopreservó espermatóforos completos de A mexicanum utilizando sucrosa como principal crioprotector, reportando 84 % de espermatozoides vivos después de ser descongelados; sin embargo, no reporta el parámetro de espermatozoides vivos antes de su congelación. Se sabe que la manipulación in vitro de los espermatozoides ocasiona alteraciones en su membrana plasmática, en la cual se ha descrito la presencia de carbohidratos membranales, los cuales tienen una función en el reconocimiento entre gametos para lograr la fertilización (Peláez et al., 2011).

Debido a que es limitada la base de datos sobre estudios morfológicos y de criopreservación en espermatozoides de anfibios, en específico del orden Urodelo (Browne y Chester, 2011; Chester, 2013; Sunny et al., 2014).

El objetivo de esta investigación fue identificar los parámetros de evaluación básica y características membranales en espermatozoides provenientes de diferentes ejemplares y espermatóforos de cada uno, para evaluar un protocolo de criopreservación que permita mantener su capacidad fertilizante post descongelación.

 MATERIAL Y MÉTODOS Cuidado y bienestar

El manejo de los ajolotes se llevó a cabo en las instalaciones del Centro de Investigaciones Biológicas y Acuícolas de Cuemanco (CIBAC-UAMX), con apego al Plan de Manejo, autorizado por la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT) a la Unidad de Para el Manejo y Conservación de la Vida Silvestre (UMA) CIBAC, con registro DGVS-CR-IN 0952-D.F./07/UMA CIBAC.

 Alojamiento y obtención de espermatóforos

Los ajolotes fueron alojados para su monitoreo durante un año de manera individual en contenedores de 60 L, a una temperatura de 18°C, con un fotoperiodo de 12 h luz y 12 h de obscuridad. Para estimular la liberación de espermatóforos, los machos se trasladaron a un contenedor de cristal con capacidad de 700 L de agua, el cual se acondicionó con suelo arenoso y plantas acuáticas; durante las horas de obscuridad, utilizando chiller de 0.25 HP (Ártica Resun CL-600), se redujo la temperatura del agua; de igual manera para todos los ejemplares de 18 °C a 14°C, introduciendo 3 hembras por macho. Los espermatóforos fueron recuperados del fondo del contenedor, al inicio de las siguientes 12 horas de luz.

 Manejo de espermatóforos y obtención de espermatozoides

Los espermatóforos liberados por cada ejemplar fueron recolectados a 5 °C en 2 ml de medio Simplified Amphibian Ringer (SAR), compuesto por NaCl 113 mM, CaCl 1mM, KCl 2.0 mM y NaHCO 3.6 mM, con 220 mOsmol kg-1. Los espermatozoides se obtuvieron colocando los espermatóforos de cada ejemplar en una caja NuncMR de 4 pozos con 0.5 ml de medio SAR; en el primer pozo se lavaron para eliminar residuos de materia orgánica; en el segundo pozo se retiró el material gelatinoso (glucoproteínas) para obtener el capuchón que contiene los espermatozoides; en el tercer pozo se utilizó 0.5 ml de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 20%, para reblandecer el capuchón por 10 min (Taku et al., 2004); en el cuarto pozo con 0.5 ml de medio SAR, los espermatozoides se extrajeron por maceración del capuchón. Mediante aspiración se extrajeron los espermatozoides del sobrenadante, enseguida se filtraron con una malla de 30 µm y se recuperó el total de espermatozoides de los espermatóforos de cada liberación en un tubo Eppendorf con 500 µl de medio SAR a 5°C, para realizar un pool espermático de cada liberación.

 Criopreservación espermática

Cada pool espermático, conservado a 5°C, se ajustó con 6% de Dimetilacetamida (DMA), enseguida se llenaron pajillas de 0.25 ml, para mantener en equilibrio por 10 min a 2°C, luego se colocaron a 5 cm sobre vapor de nitrógeno a -76 °C por 15 minutos y posteriormente se sumergieron en nitrógeno líquido a -196°C, para ser criopreservados por 30 días hasta su posterior descongelación a 15 °C por 5 min (Atencio et al., 2013).

 Evaluación espermática básica

El porcentaje de espermatozoides vivos, se determinó a través de un frotis que se realizó con una mezcla 1:5 espermatozoides con tinción de eosina-nigrosina, en la cual se contaron 100 espermatozoides bajo el microscopio a 40X; Se consideraron espermatozoides vivos, los no teñidos y muertos, los que presentaron tinción. La morfología espermática fue evaluada en la misma tinción, para determinar porcentajes de espermatozoides con alteraciones morfológicas en las regiones de la cabeza, cuello o flagelo (Tanisław et al., 2017).

 Distribución de carbohidratos membranales

Con el uso de las lectinas de Triticum vulgaris aglutinina (WGA), con afinidad a residuos de N-Acetilglucosamina y de Arachis hypogaea (PNA) con afinidad a β-galactosa, aconjugadas a isotiocianato de fluoresceína (FICT), se pretendió determinar la presencia de los carbohidratos que se ha reportado son receptores para el reconocimiento entre los gametos (Herrera et al., 2017) y como partes estructurales del plasmalema espermático (Miller, 2015 ). En un volumen final de 40 µl de medio SAR, con 5x106 espermatozoides, se adicionó 10µl de WGA-FICT o PNA-FITC a una concentración de 15 mg/ml; se incubaron a 25ºC por 30 minutos, estos espermatozoides cubriéndolos de la luz; enseguida se realizaron preparaciones sobre porta objetos, para observarlas al microscopio. Cada preparación se observó directamente en un microscopio de fluorescencia a 260 nm de excitación y >560 nm emisión, contabilizando 100 espermatozoides. Se determinó la presencia de los carbohidratos membranales, mediante patrones de fluorescencia y la proporción de espermatozoides con cada patrón determinado (Naofumi, 2015).

 Análisis estadístico

Se determinó la frecuencia de espermatozoides vivos, con morfología normal y con los diferentes patrones de fluorescencia en las muestras frescas y descongeladas, las cuales fueron expresadas como proporción con su respectivo error estándar (EE). Las diferentes variables fueron comparadas entre los grupos de espermatozoides en fresco y descongeladas con una prueba de Xi2, con un una alfa de 0.05; utilizando el paquete estadístico de libre acceso EpiInfo 7.3

RESULTADOS

Se determinó diferente cantidad de eventos reproductivos y número de espermatóforos liberados por cada ejemplar; se obtuvieron un total de 61 espermatóforos. La frecuencia en la cantidad de espermatóforos liberados por ejemplar, fue la siguiente: 1:12, 2:10, 1:8, 1:6, 3:4 y 1:3. La concentración espermática tuvo un promedio de 2.6 ± 0.6 X104 espermatozoides/ ml, con un rango entre 1.0 ± 2.5 a 4.0 ± 3.0. La concentración espermática en liberaciones con seis o más espermatóforos (2.5X104 espermatozoides/ml), fue mayor (P<0.05) a la concentración de espermatozoides (2.5X104 espermatozoides/ml) en liberaciones con menos de seis espermatóforos.

Parámetros de evaluación espermática

Los porcentajes de espermatozoides vivos disminuyeron (P<0.05), aproximadamente 30% en post descongelación; encontrando promedios de 89 % en espermatozoides en fresco y del 58 % post descongelación. Los porcentajes de espermatozoides vivos que se determinaron en liberaciones con diferente número de espermatóforos, mostró diferencias (P<0.05), encontrando un rango de 79% al 100 % en espermatozoides en fresco y del 45 % al 67 %, en espermatozoides descongelados (tabla 1).

Parámetros de evaluación espermática en fresco y post descongelación de <italic>A. mexicanum,</italic> en eyaculados de cada ejemplar evaluado
ID Espermatóforos n= % Espermatozoides con Patrón A ± EE % Espermatozoides con Patrón B ± EE
Fresco Descongelado Xi2 p Fresco Descongelado Xi2 p
A 12 46 ± 3 51 ± 7 0.3 >0.05 54 ± 3 50 ± 7 0.1>0.05
B 10 44 ± 3 46 ± 3 0.02>0.05 48 ± 4 53 ± 3 0.3>0.05
C 10 52 ± 4 56 ± 6 0.2>0.05 47 ± 4 43 ± 6 0.2>0.05
D 8 56 ± 5 55 ± 8 0.01>0.05 46 ± 5 46 ± 8 1.0>0.05
E 6 52 ± 3.5 57 ± 9 0.3>0.05 47 ± 3 43 ± 9 0.2>0.05
F 4 49 ± 7.7 57 ± 7 0.9>0.05 61 ± 4 42 ± 7 6.5<0.05
G 4 41 ± 4.2 55 ± 6 3.9<0.05 59 ± 4 a 45 ± 6 3.9<0.05
H 4 45 ± 7.3 56 ± 6 2<0.05 55 ± 7 44 ± 6 2.0>0.05
I 3 45 ± 2.8 55 ± 5 1.6<0.05 65 ± 3 45 ± 5 7.3<0.05

La morfología espermática normal de igual manera mostró una reducción (P<0.05) de aproximadamente el 15 %, encontrando porcentajes del 98 % en morfología normal de espermatozoides en fresco y del 83 % post descongelación. Los porcentajes de espermatozoides con morfología normal que se determinaron en liberaciones con diferente número de espermatóforos, no mostró diferencias (P>0.05), encontrando un rango promedio de 95% al 100% en espermatozoides en fresco; sin embargo, determinados post descongelación fue diferente (P<0.5), con porcentajes con rango promedio entre 78% al 90% (tabla 1).

 Presencia y distribución de carbohidratos membranales

Con el uso de la lectina WGA-FITC: En espermatozoides en fresco y post descongelación, la intensidad de la fluorescencia que emitió la lectina WGA-FITC sobre la membrana del espermatozoide, evidenció la presencia de residuos de N-Acetil glucosamina presentes en la membrana espermática de A mexicanum. Se determinaron dos patrones de fluorescencia denominados: Patrón A) Con fluorescencia intensa homogénea en la región del flagelo y cuello y con menor intensidad, pero evidente en la región de la cabeza (figura 1A); y patrón B), con fluorescencia evidente homogénea en toda la estructura espermática (figura 1B).

Patrones de fluorescencia de espermatozoide con la lectina WGA-FITC. 1A). Se observa mayor intensidad de fluorescencia en las regiones del flagelo y cuellos y con menor intensidad en la cabeza. 1B se observa con intensidad homogénea en toda la estructura espermática

Literal diferente en súper índice (a,b,c), indica diferencia (P<0.05) al comparar la misma variable entre columnas (Fresco VS Descongelado). Número diferente en súper índice (1,2,3), indica diferencia (P<0.05) al comparar los promedios en la misma columna

La proporción de patrones determinados con WGA-FITC (tabla 2), mostraron que:

Porcentajes de espermatozoides en fresco y post descongelación, con dos patrones de fluorescencia A y B determinados con el uso de la lectina WGA-FITC
ID Espermatóforos n= % Espermatozoides con Patrón A ± EE % Espermatozoides con Patrón B ± EE
Fresco Descongelado Xi2 p Fresco Descongelado Xi2 p
A 12 46 ± 3 51 ± 7 0.3 >0.05 54 ± 3 50 ± 7 0.1 >0.05
B 10 44 ± 3 46 ± 3 0.02>0.05 48 ± 4 53 ± 3 0.3>0.05
C 10 52 ± 4 56 ± 6 0.2>0.05 47 ± 4 43 ± 6 0.2>0.05
D 8 56 ± 5 55 ± 8 0.01>0.05 46 ± 5 46 ± 8 1.0>0.05
E 6 52 ± 3.5 57 ± 9 0.3>0.05 47 ± 3 43 ± 9 0.2>0.05
F 4 49 ± 7.7 57 ± 7 0.9>0.05 61 ± 4 42 ± 7 6.5<0.05
G 4 41 ± 4.2 55 ± 6 3.9<0.05 59 ± 4 a 45 ± 6 3.9<0.05
H 4 45 ± 7.3 56 ± 6 2<0.05 55 ± 7 44 ± 6 2.0>0.05
I 3 45 ± 2.8 55 ± 5 1.6<0.05 65 ± 3 45 ± 5 7.3<0.05

Literal diferente en súper índice (a,b,c), indica diferencia (P<0.05) al comparar la misma variable entre columnas (Fresco vs Descongelado).

El porcentaje de espermatozoides con patrón A, procedentes de liberaciones de doce a seis espermatóforos, fueron similares (P>0.05) en fresco y post descongelación; en comparación con los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones entre ocho y tres espermatóforos, en los que se incrementó (P<0.05), en espermatozoides descongelados. Al comparar los porcentajes de espermatozoides con patrón A, obtenidos en espermatozoides de cada ejemplar en fresco, se determinó en promedio 48%, con rango entre 44% a 56%; sin encontrar diferencia (P<0.05) entre éstos, en espermatozoides descongelados; se determinó un promedio de 54% con rango entre 46% a 57%, encontrando porcentajes mayores (P>0.05), en espermatozoides con el patrón A, procedentes de liberaciones con 3 y 4 espermatóforos.

Los porcentajes de espermatozoides con patrón B, procedentes de liberaciones de doce a seis espermatóforos fueron similares (P>0.05) en fresco y post descongelación; los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones con cuatro y tres espermatóforos, fueron mayores (P<0.05) en fresco, comparados con los descongelados. En fresco se determinó en promedio 53%, con rango entre 46 a 65%, sin encontrar diferencia (P<0.05) entre éstos; en espermatozoides descongelados, se determinó un promedio de 46 % con rango entre 42% a 53%, encontrando porcentajes mayores (P>0.05) en espermatozoides procedentes de liberaciones con 10 y 12 espermatóforos. Al realizar la comparación general total (Pool) de los porcentajes, fue evidente una diferencia y de manera inversa el por porcentajes totales determinados, los cuales fueron para espermatozoides con el Patrón A: Xi 2 de 7.21 p<0.05, en semen fresco con 47.7 % y de 54.3 % para semen descongelado; con respecto a espermatozoides con el Patrón B: se determinó una Xi 2 de 10.8 p<0.05, en semen fresco con 53.5 % y de 45.6 % en semen descongelado.

Con el uso de la lectina PNA-FITC: en espermatozoides en fresco y post descongelación, la intensidad de la fluorescencia que emitió la lectina PNA-FITC sobre la membrana del espermatozoide, lo que evidenció la presencia de residuos glicosídicos de β-galactosa, presentes en la membrana del espermatozoide de A mexicanum. Se determinaron dos patrones de fluorescencia: C) Con fluorescencia intensa y homogénea a lo largo de toda la estructura espermática (figura 2A); patrón D) Con fluorescencia tenue homogénea en toda la estructura espermática (figura 2B).

Patrones de fluorescencia obtenidos con lectina PNA-FITC: A) Con fluorescencia intensa homogénea, B) Con fluorescencia tenue homogénea

La proporción de patrones determinados con PNA-FITC, (tabla 3), mostró que:

Porcentajes de espermatozoides en fresco y post descongelación, con dos patrones de fluorescencia C y D determinados con el uso de la lectina PNA-FITC
ID Espermatóforos n= %±EE Espermatozoides con Patrón C %±EE Espermatozoides con Patrón D
Fresco Descongelado Xi 2 p Fresco Descongelado Xi 2 p
A 12 51±4 47±5 0.2>0.05 49±4 53±5 0.2>0.05
B 10 51±5 49±5 0.02>0.05 49±5 50±5 0.01>0.05
C 10 53±5 52±6 0.01>0.05 48±7 47±6 0.01>0.05
D 8 49±4 66±3 5.23<0.05 51±5 24±6 14.4<0.05
E 6 57±4 60±7 0.08>0.05 47±7 40±11 0.7>0.05
F 4 55±7 62±4 0.07>0.05 45±10 37±4 1.01>0.05
G 4 55±4 68±6 0.7>0.05 55±6 44±7 2.0>0.05
H 4 57±3 69±4 2.6>0.05 52±6 42±6 1.62>0.05
I 3 58±5 67±5 1.36>0.05 42±8 43±9 0.01>0.05

Literales diferentes en súper índice (a,b,c), indica diferencia (P<0.05) al comparar la misma variable entre columnas (Fresco VS Descongelado).

Con los patrones C y D, los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones entre 6 a 12 espermatóforos fueron similares (P>0.05) en fresco y post descongelación, en comparación con los porcentajes de espermatozoides procedentes de liberaciones con tres y cuatro espermatóforos, que se incrementaron (P<0.05), en espermatozoides descongelados.

Los porcentajes de espertmatozoides con patrón C y D, determinados con la lectina PNA- FITC, únicamente mostraron diferencia (P<0.05) post descongelación, cuando los espermatoziodes provinieron de liberaciones con ocho espermatóforos, observando mayor porcentaje en espermatozoides con patrón C post descongelación y de manera inversa, en espermatozoides con el patrón D. El porcentaje fue mayor en semen fresco, en los porcentajes de espermatozoides provenientes de liberaciones con doce, diez, seis, cuatro o tres espermatóforos, Al comparar los porcentajes de espermatozoides con el Patrón C de cada ejemplar, en fresco con un promedio de 54%, con rango entre 49% a 58% y post descongelación con promedio de 60% y con rango entre 47% a 69%, no se encontraron diferencias (P<0.05).

Al comparar los porcentajes de espermatozoides con patrón D de cada ejemplar, en fresco con un promedio de 48%, con rango entre 42% a 55% no se observaron porcentajes diferentes (P<0.05). En espermatozoides descongelados se encontró en promedio de 42% con rango entre 24% a 53%, tampoco se observaron porcentajes diferencias (P<0.05).

 DISCUSIÓN

En cuanto a la concentración espermática, los datos mostraron que existen diferencias entre espermatóforos de un mismo ejemplar y entre ejemplares. Estos resultados son similares a los publicados por Doyle et al. (2011), en el número de espermatozoides entre los espermatóforos liberados de ejemplares de A maculatum. La cantidad y el tamaño de los espermatóforos que pueden ser liberados varía ampliamente, relacionándose con la fisiología y adaptación reproductiva de cada especie (Browne et al., 2019); así como de tres características físicas: tamaño corporal, tamaño de los testículos o la edad (Uribe y Mejía-Roa, 2014), lo cual también fue observado en nuestro estudio. La viabilidad espermática observada en fresco fue de 80 a 98%, siendo este el primer trabajo que registra el porcentaje de espermatozoides vivos extraídos de los espermatóforos. Estos resultados se contraponen a los reportados por Mansour et al. (2011), quienes obtuvieron espermatozoides por medio de masaje cloacal, reportando un 100% de espermatozoides vivos en todas las muestras analizadas.

Por otra parte, un estudio realizado por Chester (2013), menciona que obtuvo de 64 a 86 % de viabilidad espermática después de llevar a cabo la criopreservación de espermatóforos. Estos datos difieren de lo obtenido en este trabajo, donde la viabilidad obtenida en espermatozoides descongelados estuvo en un promedio de 45 a 68 %, por lo que este resultado nos indica que la membrana del capuchón puede funcionar como una barrera, la cual protege a los espermatozoides de los cambios bruscos de la congelación (Chester, 2013; Hall et al., 2016).

La utilización de lectinas WGA-FITC y PNA-FITC mostró ser una alternativa para identificar la presencia y distribución de los residuos glucosídicos B-galactosa y Acetil- glucosamina. Estos resultados concuerdan con el trabajo realizado por Sáez et al., (2004), en donde se determinó que en el momento de la espermatogénesis diferentes carbohidratos entre ellos B- galactosa y acetilglucosamina se presentan en la membrana de las células que se encuentran en diferente etapa de desarrollo durante la espermiogénesis.

La presencia y distribución de los residuos glucosídicos, indica diferencias a lo largo de toda la membrana, lo cual se determinó con cada lectina, que cada una identificó al menos dos patrones de fluorescencia diferentes; los cuales pueden estar asociados a diferentes estados metabólicos de los espermatozoides que les permitan o no el reconocimiento entre gametos.

La presencia y distribución de los residuos glucosídicos permite caracterizar la membrana de los espermatozoides que se encuentren en diferente estado metabólico, asociados a la capacitación y reacción acrosomal, y por lo cual su capacidad fertilizante, (Browne et al., 2015). Lo anterior puede ser de utilidad en protocolos de reproducción asistida que involucren el manejo in vitro de los espermatozoides.

Utilizando la reproducción asistida en cautiverio, se contribuye a la conservación de la especie; además de disminuir la extracción de animales de su medio y venta ilegal (Jimenez et al., 2017); los cuales pueden tener un aprovechamiento sustentable destinando ejemplares a la conservación, investigación biomédica y conservación en colecciones públicas y privadas (Prieto et al., 2014), que es en estas últimas, en las cuales es donde se han reproducido los ejemplares fuera de su hábitat natural; sin embargo, la reproducción de anfibios y su cría en cautiverio es relativamente mínimo (Ananjeva et al., 2015).

 CONCLUSIÓN

El protocolo de criopreservación utilizado demostró ser eficiente, manteniendo parámetros de viabilidad e integridad membranal, a pesar de encontrar diferencias espermáticas asociadas al número de espermatóforos presentes en cada liberación, por lo cual este estudio aporta herramientas y conocimientos para la reproducción asistida en cautiverio del Ambystoma mexicanum.

 LITERATURA CITADA Ananjeva NB, Uteshev VK, Orlov NL, Gakhova EN. 2015. Strategies for conservation of endangered amphibian and reptile species. Biological Bulletin. 42:432-439. https://link.springer.com/article/10.1134/S1062359015050027 Ananjeva NB Uteshev VK Orlov NL Gakhova EN. 2015 Strategies for conservation of endangered amphibian and reptile species Biological Bulletin 42 432 439 10.1134/S1062359015050027 Atencio V, Pérez E, Espinosa J, Pardo S. 2013. Evaluación de dimetilacetamida como crioprotector para la crioconservación de semen de Bocachico prochilodus magdalenae. Archivos de Medicina Veterinaria. 45(2):151-158. http://dx.doi.org/10.4067/S0301-732X2013000200006 Atencio V Pérez E Espinosa J Pardo S. 2013 Evaluación de dimetilacetamida como crioprotector para la crioconservación de semen de Bocachico prochilodus magdalenae Archivos de Medicina Veterinaria 45 2 151 158 10.4067/S0301-732X2013000200006 Browne R, Chester R. Figiel Jr. 2011. 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Code:2020-80

 Abstract:

Ambystoma mexicanum is in danger of extinction in free-living, due to anthropogenic actions; sperm cryopreservation for captive breeding can help in its ex-situ conservation. This research aimed to identify the viability of fresh and post-thawing sperm from different spermatophores. During the breeding season, spermatophores releasing was induced in nine specimens by reducing water temperature. The mean concentration per spermatophores was 2.6 ± 0.6 x104 sperm. A reduction of 30 % of living sperms and an increase of 15 % of abnormal morphology were determined in fresh and post-thawing sperm. With the WGA and PNA lectins bounded to FITC, two different fluorescence patterns were determined in each one, which showed the membrane presence and distribution of N-acetyl glucosamine, sialic acid, and mannose respectively. Sperm percentages in each fluorescence pattern showed differences associated with the number of spermatophores in each release. Differences in sperm viability from releases with different numbers of spermatophores were determined. The sperm collection and cryopreservation protocol of A mexicanum were efficient as tools for using cryopreserved semen for ex situ reproduction.

 Keywords<italic>:</italic> Amphibian conservation spermatophore urodele INTRODUCTION

The decrease in amphibian populations has led them to extinction in severe cases, the main causes are pollution, modification of their habitat, the introduction of invasive exotic species and diseases (Catenazzi, 2015; Jiménez et al., 2017; Tietje and Rödel, 2018). Currently, the International Union for the Conservation of Nature (IUCN, 2020). Indicates than more than 85% of amphibian species of Mexico are in risk, due to this situation, most of species of Ambystoma genre in wildlife, at present it has been chosen to reproduce them in laboratory conditions (Mendoza, 2012; Khattak et al., 2014; Jiménez et al., 2017). Specifically Ambystoma mexicanum is included in NOM-059-SEMARNAT- 2010 as an endangered species (NOM-059-ECOL, 2010).

Ex situ reproduction using cryopreserved semen is an assisted reproduction tool in captivity that can contribute to the Ambystoma mexicanum´s conservation, besides to help the increase its genetic variability since most of the cases the threat is in its own habitat (Clulow et al., 2014; Jiménez et al., 2017). However, before implementing of a spermatic cryopreservation protocol, it is necessary to know reproductive biology and spermatic characteristics of species, to achieve greater success (Chester, 2013; Silla y Byrne, 2019).

Nowadays, techniques for obtaining gametes (sperm and ovules) that are carried out in amphibians are highly invasive, since most of processes require the sacrifice of the specimen to extract the testes and efferent ducts and proceed to macerate them (Chester, 2013; Shishova et al., 2011). Most of cryopreservation protocols used in sperm of diverse amphibian species have been extrapolated from those reported in fish (Comizzoli et al., 2012) showing variable results between each one. Chester (2013) cryopreserved complete spermatophores of A mexicanum using sucrose as the main cryoprotector, reporting 84 % of live spermatozoa after being thawed, however, it was not reported the parameter of live spermatozoa before its freezing.

It is known that in vitro manipulation of sperm causes alterations in their plasma membrane, in which the presence of membrane carbohydrates has been described, which have a role in the recognition between gametes to achieve fertilization (Peláez et al., 2011).

Because of the database on morphological and cryopreservation studies in amphibian spermatozoa, specifically of the order Urodelo, is limited (Browne and Chester, 2011; Chester, 2013; Sunny et al., 2014).

The objective of this research was to identify the basic evaluation parameters and membrane characteristics in spermatozoa from different specimens and spermatophores from each, to evaluate a cryopreservation protocol that allows maintaining their post-thaw fertilizing capacity.

 MATERIAL AND METHODS Care and well-being

The axolotl management was carried out in the Center for Biological and Aquaculture Research of Cuemanco (CIBAC-UAMX) facilities, in accordance with the Management Plan, authorized by the Ministry of Environment and Natural Resources (SEMARNAT) to the Unit of for the Management and Conservation of Wildlife (UMA) CIBAC, with registration DGVS-CR-IN 0952-DF/07/UMA CIBAC.

 Accommodation and collection of spermatophores

The axolotls were housed for monitoring for one year individually in 60 L containers, at a temperature of 18 °C, with a photoperiod of 12 h light and 12 h of darkness. To stimulate spermatophore release, the males were transferred to a glass container with a capacity of 700 L of water, which was conditioned with sandy soil and aquatic plants. During darkness hours, using a 0.25 HP chiller (Ártica Resun CL-600), the water temperature was reduced; in the same way for all specimens from 18 to 14 °C, introducing 3 females per male. The spermatophores were recovered from the bottom of the container, at the beginning of the next 12 hours of light.

 Spermatophore management and sperm collection

The spermatophores released by each specimen were collected at 5 °C in 2 ml of Simplified Amphibian Ringer (SAR) medium, composed of 113 mM NaCl, 1mM CaCl, 2.0 mM KCl and 3.6 mM NaHCO, with 220 mOsmol kg-1. Spermatozoa were obtained by placing the spermatophores of each specimen in a 4-well NuncMR box with 0.5 ml of SAR medium; in the first well, they were washed to remove organic matter residues; In the second well, the gelatinous material (glycoproteins) was removed to obtain the cap containing the sperm; in the third well, 0.5 ml of 20% Sodium Hydroxide (NaOH) was used to soften the cap for 10 min (Taku et al., 2004); in the fourth well with 0.5 ml of SAR medium, the spermatozoa were extracted by cap maceration. By aspiration, the sperm were extracted from the supernatant, then they were filtered with a 30 µm mesh and the total sperm were recovered from the spermatophores of each release in an Eppendorf tube with 500 µl of SAR medium at 5 °C, to make a pool sperm of each release.

 Sperm cryopreservation

Each sperm pool, kept at 5 °C, was adjusted with 6% Dimethylacetamide (DMA), then 0.25 ml straws were filled, to maintain equilibrium for 10 min at 2 °C, then they were placed at 5 cm on steam of Nitrogen at -76 °C for 15 minutes and subsequently submerged in liquid nitrogen at -196 ° C, to be cryopreserved for 30 days until later thawing at 15 ° C for 5 min (Atencio et al., 2013).

 Basic sperm evaluation

The percentage of live spermatozoa was determined through a smear that was made with a 1:5 mixture of spermatozoa with eosin-nigrosin staining, in which 100 spermatozoa were counted under the microscope at 40X. Live spermatozoa were considered, those not stained and dead, those that presented staining. Sperm morphology was evaluated in the same staining, to determine percentages of sperm with morphological alterations in the head, neck or flagellum regions (Tanisław et al., 2017).

 Membrane carbohydrate distribution

With the use of lectins from Triticum vulgaris agglutinin (WGA), with affinity to N- Acetylglucosamine residues and Arachis hypogaea (PNA) with affinity to β-galactose, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FICT), it was intended to determine the carbohydrate presence that have been reported are receptors for recognition between gametes (Herrera et al., 2017) and as structural parts of the spermatic plasmalemma (Miller, 2015). In a final volume of 40 µl of SAR medium, with 5x106 spermatozoa, 10 µl of WGA-FICT or PNA-FITC was added at a concentration of 15 mg/ml. They were incubated at 25 ºC for 30 minutes, these spermatozoa covering them with light; immediately, preparations were made on object slides, to be observed under the microscope. Each preparation was observed directly under a fluorescence microscope at 260 nm excitation and> 560 nm emission, counting 100 spermatozoa. The presence of membrane carbohydrates was determined by fluorescence patterns and sperm proportion with each determined pattern (Naofumi, 2015).

 Statistical analysis

The frequency of live sperm was determined, with normal morphology and with the different fluorescence patterns in the fresh and thawed samples, which were expressed as a proportion with their respective standard error (SE). The different variables were compared between the groups of fresh and thawed spermatozoa with a Xi2 test, with an alpha of 0.05; using the free access statistical package EpiInfo 7.3.

RESULTS

Different quantity of reproductive events and number of spermatophores released by each specimen were determined. A total of 61 spermatophores were obtained. The frequency in the quantity of spermatophores released per specimen was the following: 1:12, 2:10, 1: 8, 1: 6, 3: 4 and 1: 3. The sperm concentration averaged 2.6 ± 0.6 X104 sperm/ml, with a range between 1.0 ± 2.5 to 4.0 ± 3.0. The sperm concentration in releases with six or more spermatophores (2.5X104 spermatozoa/ml), was higher (P <0.05) than the sperm concentration (2.5X104 spermatozoa/ml) in releases with less than six spermatophores.

Sperm evaluation parameters

The percentages of live sperm decreased (P <0.05), approximately 30% in post-thaw; finding averages of 89% in fresh sperm and 58% post-thaw. Live sperm percentages that were determined in releases with different spermatophore numbers showed differences (P <0.05), finding a range of 79% to 100% in fresh sperm and from 45% to 67% in thawed sperm (Table 1).

Fresh and post-thaw sperm evaluation parameters of <italic>A. mexicanum,</italic> in ejaculates of each evaluated specimen
ID Spermatophores n= %Spermatozoa with A pattern ± SE % Spermatozoa with B pattern ± SE
Fresh Thawed Xi2 p Fresh Thawed Xi2 p
A 12 46 ± 3 51 ± 7 0.3>0.05 54 ± 3 50 ± 7 0.1>0.05
B 10 44 ± 3 46 ± 3 0.02>0.05 48 ± 4 53 ± 3 0.3>0.05
C 10 52 ± 4 56 ± 6 0.2>0.05 47 ± 4 43 ± 6 0.2>0.05
D 8 56 ± 5 55 ± 8 0.01>0.05 46 ± 5 46 ± 8 1.0>0.05
E 6 52 ± 3.5 57 ± 9 0.3>0.05 47 ± 3 43 ± 9 0.2>0.05
F 4 49 ± 7.7 57 ± 7 0.9>0.05 61 ± 4 42 ± 7 6.5<0.05
G 4 41 ± 4.2 55 ± 6 3.9<0.05 59 ± 4 a 45 ± 6 3.9<0.05
H 4 45 ± 7.3 56 ± 6 2<0.05 55 ± 7 44 ± 6 2.0>0.05
I 3 45 ± 2.8 55 ± 5 1.6<0.05 65 ± 3 45 ± 5 7.3<0.05

Different letter in superscript index (a,b,c), indicates difference (P<0.05) when comparing the same variable between columns (Fresh vs Thawed). Different number in superscript (1,2,3), indicates difference (P<0.05) when comparing averages in the same column

Similarly, normal sperm morphology showed a reduction (P <0.05) of approximately 15%, finding percentages of 98% in normal fresh sperm morphology and 83% post-thaw. Spermatozoa percentages with normal morphology that were determined in releases with different spermatophore numbers did not show differences (P> 0.05), finding an average range of 95% to 100% in fresh spermatozoa. However, certain post-thaw was different (P<0.5), with percentages with an average range between 78% and 90% (Table 1).

 Presence and distribution of membrane carbohydrates

With the use of the WGA-FITC lectin: In fresh and post-thaw sperm, the fluorescence intensity emitted by the WGA-FITC lectin on the sperm membrane, evidenced the presence of N-Acetyl glucosamine residues present in the spermatic membrane of A mexicanum. Two fluorescence patterns were determined called: A pattern) with homogeneous intense fluorescence in the flagellum and neck region and with less intensity, but evident in the head one (Figure 1A); and B pattern), with evident homogeneous fluorescence throughout the sperm structure (Figure 1 B).

Sperm fluorescence patterns with WGA-FITC lectin. 1A). Higher fluorescence intensity is observed in the flagellum and neck regions and with less intensity in the head. 1B is observed with homogeneous intensity throughout the spermatic structure

The proportion of patterns determined with WGA-FITC (table 2), showed that:

Percentages of fresh and post-thaw sperm, with two fluorescence patterns A and B determined with the use of the WGA-FITC lectin
ID Spermatophores n= % Spermatozoa with pattern A ± SE % Spermatozoawith pattern B ± SE
Fresh Thawed Xi2 p Fresh Thawed Xi2 p
A 12 46 ± 3 51 ± 7 0.3>0.05 54 ± 3 50 ± 7 0.1>0.05
B 10 44 ± 3 46 ± 3 0.02>0.05 48 ± 4 53 ± 3 0.3>0.05
C 10 52 ± 4 56 ± 6 0.2>0.05 47 ± 4 43 ± 6 0.2>0.05
D 8 56 ± 5 55 ± 8 0.01>0.05 46 ± 5 46 ± 8 1.0>0.05
E 6 52 ± 3.5 57 ± 9 0.3>0.05 47 ± 3 43 ± 9 0.2>0.05
F 4 49 ± 7.7 57 ± 7 0.9>0.05 61 ± 4 42 ± 7 6.5<0.05
G 4 41 ± 4.2 55 ± 6 3.9<0.05 59 ± 4 a 45 ± 6 3.9<0.05
H 4 45 ± 7.3 56 ± 6 2<0.05 55 ± 7 44 ± 6 2.0>0.05
I 3 45 ± 2.8 55 ± 5 1.6<0.05 65 ± 3 45 ± 5 7.3<0.05

Different letter in superscript (a,b,c), indicates difference (P<0.05) when comparing the same variable between columns (Fresh vs Thawed).

The percentage of sperm with A pattern, from releases of twelve to six spermatophores, were similar (P> 0.05) fresh and post-thaw; in comparison with the percentages of sperm from releases between eight and three spermatophores, in which it increased (P <0.05), in thawed sperm. When comparing the percentages of sperm with pattern A, obtained in fresh sperm from each specimen, an average of 48% was determined, with a range between 44% and 56%; without finding difference (P <0.05) between these, in thawed spermatozoa. An average of 54% was determined with a range between 46% to 57%, finding higher percentages (P> 0.05), in sperm with pattern A, from releases with 3 and 4 spermatophores.

The percentages of sperm with B pattern, from releases of twelve to six spermatophores, were similar (P> 0.05) fresh and post-thaw; the percentages of sperm from releases with four and three spermatophores were higher (P <0.05) when fresh, compared to those thawed. In fresh, an average of 53% was determined, with a range between 46 to 65%, without finding a difference (P <0.05) between them; in thawed sperm, an average of 46% was determined with a range between 42% to 53%, finding higher percentages (P> 0.05) in sperm from releases with 10 and 12 spermatophores.

When carrying out the total general comparison (Pool) of the percentages, a difference was evident and inversely the difference by total percentages determined, which were for sperm with A pattern: Xi 2 of 7.21 p <0.05, in fresh semen with 47.7% and 54.3% for thawed semen. Regarding sperm with B pattern: a Xi 2 of 10.8 p <0.05 was determined, in fresh semen with 53.5% and 45.6% in thawed semen.

With the use of the PNA-FITC lectin: in fresh and post-thaw sperm, the intensity of the fluorescence emitted by the PNA-FITC lectin on the sperm membrane, which evidenced the presence of β-galactose glycosidic residues, present in the sperm membrane of A mexicanum. Two fluorescence patterns were determined: C) with intense and homogeneous fluorescence throughout the entire sperm structure (Figure 2A); pattern D) with homogeneous faint fluorescence throughout the sperm structure (Figure 2B).

Fluorescence patterns obtained with PNA-FITC lectin: A) With intense homogeneous fluorescence, B) With homogeneous faint fluorescence

The proportion of patterns determined with PNA-FITC, (Table 3), showed that:

Percentages of fresh and post-thaw sperm, with two fluorescence C and D patterns determined with PNA-FITC lectin use.
ID Spermatophores n= % ± SE Spermatozoa with pattern C % ± SE Spermatozoa with pattern D
Fresco Thawed Xi 2 p Fresco Thawed Xi 2 p
A 12 51±4 47±5 0.2>0.05 49±4 53±5 0.2>0.05
B 10 51±5 49±5 0.02>0.05 49±5 50±5 0.01>0.05
C 10 53±5 52±6 0.01>0.05 48±7 47±6 0.01>0.05
D 8 49±4 66±3 5.23<0.05 51±5 24±6 14.4<0.05
E 6 57±4 60±7 0.08>0.05 47±7 40±11 0.7>0.05
F 4 55±7 62±4 0.07>0.05 45±10 37±4 1.01>0.05
G 4 55±4 68±6 0.7>0.05 55±6 44±7 2.0>0.05
H 4 57±3 69±4 2.6>0.05 52±6 42±6 1.62>0.05
I 3 58±5 67±5 1.36>0.05 42±8 43±9 0.01>0.05

Different letter in superscript (a,b,c), indicates difference (P<0.05) when comparing the same variable between columns (Fresh vs Thawed).

With C and D patterns, sperm percentages from releases with 6 to 12 spermatophores were similar (P> 0.05) fresh and post-thaw, compared to sperm percentages from releases with three and four spermatophores, which were increased (P <0.05), in thawed sperm.

Spermatozoa percentages with C and D pattern, determined with the lectin PNA-FITC, only showed a difference (P <0.05) after thawing, when the spermatozoa came from releases with eight spermatophores, observing a higher percentage in spermatozoa with C pattern post thawing and conversely, in sperm with D pattern. The percentage was higher in fresh semen, in the percentages of sperm from releases with twelve, ten, six, four or three spermatophores, When comparing the percentages of sperm with C pattern of each specimen, fresh with an average of 54%, with a range between 49% to 58 % and post thawing with an average of 60% and with a range between 47% to 69%, no differences were found (P <0.05).

When comparing the percentages of sperm with D pattern of each specimen, fresh with an average of 48%, with a range between 42% to 55%, no different percentages were observed (P <0.05). In thawed spermatozoa, an average of 42% was found, with a range 24% to 53%, no difference percentages were observed (P <0.05).

 DISCUSSION

Regarding the sperm concentration, the data showed that there are differences between spermatophores of the same specimen and between specimens. These results are similar to those published by Doyle et al. (2011), in spermatozoa number among the spermatophores released from specimens of A maculatum. The quantity and size of spermatophores that can be released varies widely, being related to the physiology and reproductive adaptation of each species (Browne et al., 2019); as well as three physical characteristics: body size, testicle size or age (Uribe and Mejía-Roa, 2014), which was also observed in our study. The sperm viability observed fresh was 80 to 98%, this being the first study to record live sperm percentage extracted from spermatophores. These results are in contrast to those reported by Mansour et al. (2011), who obtained sperm through cloacal massage, reporting 100% live sperm in all samples analyzed.

On the other hand, a study carried out by Chester (2013) mentions that it obtained from 64 to 86% of sperm viability after carrying out spermatophore cryopreservation. These data differ from that obtained in this work, where the viability obtained in thawed spermatozoa was an average of 45 to 68%, so this result indicates that the cap membrane can function as a barrier, which protects the sperm from freezing sudden changes (Chester, 2013; Hall et al., 2016).

The use of WGA-FITC and PNA-FITC lectins proved to be an alternative to identify the presence and distribution of glucosidic residues β-galactose and Acetyl-glucosamine. These results are consistent with the work carried out by Sáez et al., (2004), where it was determined that at spermatogenesis time, different carbohydrates, including β-galactose and acetylglucosamine, are present in the membrane of cells that are found in different developmental stage during spermiogenesis.

The presence and glycosidic residue distribution indicate differences throughout the entire membrane, which was determined with each lectin, which each identified at least two different fluorescence patterns; which may be associated with different metabolic states of the spermatozoa that allow or not the recognition between gametes.

The presence and distribution of glycosidic residues allows to characterize the membrane of spermatozoa that are in different metabolic state, associated with acrosomal training and reaction, and therefore their fertilizing capacity (Browne et al., 2015). This may be useful in assisted reproduction protocols that involve the in vitro sperm handling.

Using assisted reproduction in captivity, it contributes to species conservation; in addition to reducing the extraction of animals from their environment and illegal sale (Jimenez et al., 2017); which can have a sustainable use allocating specimens to conservation, biomedical research and conservation in public and private collections (Prieto et al., 2014), which is in the latter, in which specimens have been reproduced outside their natural habitat; however, amphibian reproduction and breeding in captivity is relatively minimal (Ananjeva et al., 2015).

 CONCLUSION

The cryopreservation protocol used proved to be efficient, maintaining parameters of viability and membrane integrity, despite finding sperm differences associated with the number of spermatophores present in each release, for which this study provides tools and knowledge for the assisted reproduction in Ambystoma mexicanum captivity.