av Abanico veterinario Abanico vet 2007-428X 2448-6132 Sergio Martínez González 10.21929/abavet2020.29 00116 Artículos originales Aprovechamiento de desechos de pescado y cáscara de piña para producir ensilado biológico Ramírez-Ramírez José 1 2 * 0000-0001-5020-7673 Loya-Olguín José 1 2 0000-0002-3749-3086 Ulloa José 2 3 0000-0002-4830-8755 Rosas-Ulloa Petra 2 3 0000-0003-2302-0437 Gutiérrez-Leyva Ranferi 1 2 0000-0002-7534-9712 Silva-Carrillo Yessica 2 3 Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nayarit, Compostela, México Universidad Autónoma de Nayarit Universidad Autónoma de Nayarit Compostela Mexico Posgrado en Ciencias Biológico Agropecuarias, Universidad Autónoma de Nayarit, Xalisco, México Universidad Autónoma de Nayarit Universidad Autónoma de Nayarit Xalisco Mexico Centro de Tecnología de Alimentos, Universidad Autónoma de Nayarit, Tepic, México. Universidad Autónoma de Nayarit Universidad Autónoma de Nayarit Tepic Mexico *Autor responsable y de correspondencia: José Ramírez-Ramírez. 1Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nayarit, Carretera Compostela-Chapalilla Km 3.5, Compostela Nayarit, México, C.P. 63700. (311) 1188478. ramcara60@gmail.com, arulloa5@gmail.com, joselenin28@hotmail.com, petrosas@uan.edu.mx, granferi@hotmail.com, ysilvacarrillo@gmail.com 30 04 2021 12 2020 10 e116 11 07 2020 30 10 2020 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN

Se formularon seis tratamientos para elaborar ensilado biológico con desechos de pescado, rastrojo de maíz, melaza, cáscara de piña (CP) [15, 30 y 45%] e inóculo Lactobacillus sp. o Lactobacillus B2. Los ensilados de cada tratamiento se hicieron por triplicado y se incubaron a 30°C durante 0, 2, 4, 7 y 14 días con el propósito de evaluar la acidificación bajo un diseño factorial 3 x 2 x 5. A los ensilados se les determinó la composición química y la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) al terminar la fermentación. La acidificación más alta (p<0.05) la presentaron los tratamientos con CP 15 y 30% y Lactobacillus B2 a los 7 días. Con 15% de CP se obtuvo el mayor contenido de materia seca (39.3%) (p<0.05) y la proteína cruda (26.5 a 31%, rango) fue igual (p>0.05). La concentración mayor de lípidos (9.85%) se presentó en los tratamientos con CP 30 y 45% y Lactobacillus B2. Las fracciones de fibra detergente disminuyeron al aumentar el nivel de CP y la DIVMS más alta (82.9%) se presentó en los ensilados al utilizar Lactobacillus B2, independientemente del nivel de CP (p<0.05). Los ensilados obtenidos son una alternativa para alimentación de rumiantes.

 Palabras clave: Desechos de pescado cáscara de piña ensilado biológico alimentación de rumiantes INTRODUCCIÓN

La producción pesquera mundial en 2016 alcanzó aproximadamente 171 millones de ton, de los cuales la acuicultura representó un 47% del total y la pesca 53%, sin incluir lo destinado a la producción de harina y aceite de pescado (FAO, 2018). Del procesamiento industrial del pescado derivan más de 60% de residuos constituidos por aletas, escamas, cabezas, vísceras, esqueleto, piel, huevas y restos de carne (Ghosh et al., 2016; Renuka et al., 2016). Esos desechos en muchas partes del mundo son descartados, lo cual causa una gran pérdida de nutrientes como proteínas, lípidos y minerales, además de contaminar el ambiente (Olsen y Toppe, 2017). Con los desechos de pescado se pueden producir fertilizantes, concentrados e hidrolizados de proteína, así como harina y aceite de pescado (Renuka et al., 2016; Ozyurt et al., 2017). También se han desarrollado biotécnicas para la conversión de los desechos de pescado en productos de alto valor como ácidos grasos poliinsaturados, péptidos fisiológicamente importantes, carbohidratos y otros compuestos bioactivos (Ghaly et al., 2013; Smichi et al., 2016). Sin embargo, la mayoría de esas tecnologías no son económicamente atractivas debido a que requieren alta inversión (Ozyurt et al., 2017). El insumo de mayor importancia en producción animal es la harina de pescado por su alto contenido proteico, pero debido a su alto costo en el mercado se demandan fuentes alternas de proteína (Castillo et al., 2019). El ensilado de pescado es un producto resultante de la preservación de pescado completo o partes por la adición de ácidos orgánicos o inorgánicos (ensilado químico) o por fermentación bacteriana (ensilado biológico) (Ghaly et al., 2013; Olsen y Toppe, 2017). El ensilado de pescado producido por el método biológico es una alternativa tecnológica viable desde el punto de vista económico y ambiental, el cual consiste en mezclar el desecho de pescado molido con melaza u otra fuente de carbohidratos y un cultivo iniciador de bacterias ácido lácticas (BAL) (Ramírez-Ramírez et al., 2018; Castillo et al., 2019). Durante la fermentación las BAL incrementan la producción de ácidos, principalmente láctico, por lo que el pH disminuye y se frena el deterioro microbiano; además las proteasas del pescado se activan, aceleran la proteólisis y por consecuencia la digestibilidad del producto aumenta (Ghaly et al., 2013). Así mismo, las BAL generan compuestos tales como bacteriocinas y peróxido de hidrógeno que ayudan a la conservación y diacetilo, sustancia potenciadora de aroma y sabor (Jini et al., 2011). En ese sentido, para lograr el control de la fermentación es importante la selección de cepas de BAL. Según diversos estudios, el ensilado de pescado es una fuente excelente de proteínas, lípidos y minerales con grandes propiedades biológicas para alimentación animal (Geron et al., 2007; Ghaly et al., 2013; Ramírez-Ramírez et al., 2016; Land et al., 2017), además el ensilado biológico de pescado presenta beneficios antibacterianos, antioxidantes y es una fuente posible de probióticos (Jini et al., 2011; Ozyurt et al., 2017). Por otra parte, la piña (Annanas comosus Merr.) ocupa el tercer lugar como la fruta más popular y de mayor importancia económica en el mundo, con una producción de 24’785,762 ton (FAOSTAT, 2018). De la industrialización de la piña se obtiene aproximadamente un 75% del peso del fruto como desechos, los cuales son una fuente valiosa de fibra, azúcares solubles, proteína, ácido ascórbico, vitaminas, minerales, agua y de compuestos bioactivos como la bromelina de múltiples aplicaciones (Damasceno et al., 2016; Ketnawa et al., 2012). Los desechos de piña pueden utilizarse como sustrato de buena calidad para los microorganismos en procesos fermentativos; sin embargo, muchas veces son tirados causando serios problemas de contaminación (Ketnawa et al., 2012). Por todo lo anterior, el aprovechamiento de los desechos de pescado y piña podría ser una alternativa viable y relevante desde el punto de vista económico y ambiental. Hasta donde llega nuestro conocimiento no hay reportes sobre el uso de desechos de pescado y cáscara de piña juntos. Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue evaluar el aprovechamiento de esos desechos industriales en la producción de ensilados por fermentación láctica.

MATERIAL Y MÉTODOS

Preparación de la materia prima

Desechos de pescado y cáscara de piña

Se obtuvieron desechos de pescado de especies marinas comerciales tales como Bagre panamensis, Peprilus snyderi, Sphyraena ensis, Trachynotus ovatus, Argyrosomus regius, Diplodus vulgaris y Bagre panamensis (pescado estuarino) del puerto de San Blas, Nayarit, México. Los desechos fueron procesados en un molino para carne (Marca Torrey, modelo 32-3, México) usando el cedazo de 0.5 cm de diámetro y se almacenaron a -20°C hasta su uso. La cáscara de piña (Annanas comosus Merr.) variedad Cayena lisa se obtuvo manualmente con cuchillo y se molió homogéneamente en un procesador de alimentos. En la tabla siguiente se presenta la composición química de dichos ingredientes.

Composición química (% de MS) de desechos de pescado y cáscara de piña.
Componente Derechos de pescado Cáscara de piña
Materia seca 29.72 ± 0.4 23.22 ± 0.37
Cenizas 18.94 ± 0.52 4.11 ± 0.12
Proteína cruda (Nt x 6.25) 52.43 ± 0.92 4.31 ± 0.13
Extracto etéreo 24.50 ± 0.67 3.38 ± 0.46
Fibra cruda --- 13.95 ± 0.55
Fibra neutro detergente --- 41.60 ± 1.10
Fibra ácido detergente --- 22.71 ± 0.73
ELN 4.13 74.25

Media ± desviación estándar, n = 3. ELN = 100 - % de cenizas -% de proteína cruda -% de lípidos -% de fibra cruda.

Melaza de caña y rastrojo de maíz

Se utilizó melaza de caña de un contenido de humedad de 25.15%, 10.37% de cenizas y 55.73% de carbohidratos solubles totales. Para mejorar la consistencia de los ensilados se adicionó rastrojo de maíz procesado en un molino de cuchillas usando la criba de 2 mm (Willey, model 4, Philadelphia, USA).

Inóculos

Fueron evaluadas las cepas de Lactobacillus B2 y Lactobacillus sp., siendo esta última aislada de desechos de mango en nuestro laboratorio. Los iniciadores se cultivaron en caldo MRS (de Man Rogosa and Sharpe, MRS, Merck Darmstadt) a 30 °C por 24 h hasta registrar una concentración final de 1 X 109 ufc/mL.

Producción de los ensilados

Se prepararon seis tratamientos con diferentes cantidades en proporción porcentual de desechos de pescado, CP (15, 30 y 45%, p/p), rastrojo de maíz, melaza de caña (9%, p/p). Como inóculo (I) se utilizó Lactobacillus sp. o Lactobacillus B2 al 4% (v/p) (Tabla 2). Las mezclas obtenidas se utilizaron para elaborar mini silos de 100 g en bolsas de plástico color negro. Cada tratamiento se preparó por triplicado y los silos se sellaron a vacío e incubaron a 30 °C durante 14 días.

porcentual de ingredientes utilizados en la producción de los ensilados por fermentación ácido láctica.
Ingredientes Porcentage
Desechos de pescado 57 47 37 57 47 37
Cáscara de piña 15 30 45 15 30 45
Melaza 9 9 9 9 9 9
Rastrojo de maíz 15 10 5 15 10 5
Inóculo 4A 4A 4A 4B 4B 4B

A= Lactobacillus sp aislado de desechos de mango. B= Lactobacillus B2.

Análisis químico

Los ensilados se analizaron cada 0, 2, 4, 7 y 14 días (T) para determinar el pH con un potenciómetro modelo UB10 Ultra Basic (Denver Instrument, USA) y el contenido de ácido láctico por titulación. Los ensilados obtenidos al tiempo final de la fermentación se analizaron para determinar su composición química proximal (AOAC, 2005) y los contenidos de fibra neutro detergente (FND) y fibra ácido detergente (FAD) por el método de Van Soest et al. (1991).

Digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS)

La DIVMS se determinó siguiendo la técnica de dos pasos de Tilley y Terry (1963). Las muestras de ensilado se secaron a 70 ºC por 24 h en un horno de aire forzado y se procesaron en un molino Wiley a un tamaño de partícula de 1 mm. Para colectar el líquido ruminal se usaron dos borregos Blackbelly sin castrar de 35 Kg de peso corporal y equipados con cánula en el rumen. Los ovinos se alimentaron con una dieta a base de 25% de ensilado de maíz, 25% de alfalfa y 50% de concentrado. En el segundo paso de la técnica de DIVMS se utilizó pepsina (Sigma P-7012, Sigma).

Análisis estadístico

Los datos de los parámetros fermentativos fueron tratados por análisis de varianza (ANDEVA) para un diseño factorial 3 x 2 x 5 (nivel de cáscara de piña x inóculo x tiempo de fermentación). Los datos obtenidos de la composición química y DIVMS se analizaron por ANDEVA para un diseño factorial 3 x 2 (nivel de cáscara de piña x inóculo). Al encontrarse diferencia significativa, las medias de los tratamientos fueron comparadas con la prueba de Tukey (p<0.05). El análisis se hizo con el programa Statistica 7. (Statistica, versión 7.1).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Parámetros fermentativos

El contenido de ácido láctico de los ensilados presentó diferencias significativas entre tratamientos debido a los factores inóculo (I) y tiempo de fermentación (T) (Tabla 3). Las mezclas sin fermentar presentaron el contenido más bajo de ácido láctico (promedio 0.55 ± 0.15%) sin existir diferencia entre esos tratamientos (p>0.05). Sin embargo, entre los días 2 y 7 del proceso, la mayoría de los tratamientos con Lactobacillus B2 presentaron la concentración máxima de ácido láctico (promedio 3.42 ± 0.17%). El alto poder acidificante de Lactobacillus B2 se ha reportado anteriormente (Ramírez-Ramírez et al., 2008; 2018) y en este trabajo se reafirma. Los resultados obtenidos concuerdan con valores de 2.96 a 4.42% de ácido láctico reportados recientemente para ensilado biológico adicionado con mezclas de desechos de pescado y mango (Ramírez-Ramírez et al., 2018), así como con los valores de 2.96 y 3.08% de ácido láctico para ensilados fermentados de cabeza de langostino y residuos de pescado; respectivamente (Castillo et al., 2019).

Efecto del nivel de cáscara de piña, inóculo y tiempo de fermentación sobre el contenido de ácido láctico y pH de los ensilados.
Nivel de cáscara de piña (CP) (%) Inóculo (I) Tiempo de fermentación (T) (días) Ácido láctico (%) pH
15 A 0 0.49 ± 0.08c 6.09 ± 0.05a
15 B 0 0.43 ± 0.01c 6.05 ± 0.14a
30 A 0 0.55 ± 0.02c 5.83 ± 0.01b
30 B 0 0.73 ± 0.03c 5.60 ± 0.10c
45 A 0 0.37 ± 0.14c 5.44 ± 0.25c
45 B 0 0.72 ± 0.07c 5.32 ± 0.28c
15 A 2 2.97 ± 0.45b 4.62 ± 0.03e
15 B 2 3.37 ± 0.05a 4.65 ± 0.07e
30 A 2 2.71 ± 0.25b 4.64 ± 0.05e
30 B 2 3.32 ± 0.21a 4.52 ± 0.05e
45 A 2 2.98 ± 0.41b 4.36 ± 0.09e
45 B 2 3.14 ± 0.15ab 4.51 ± 0.05e
15 A 4 3.09 ± 0.61ab 4.69 ± 0.15de
15 B 4 3.57 ± 0.06a 4.63 ± 0.04e
30 A 4 2.78 ± 0.14b 4.65 ± 0.03e
30 B 4 3.79 ± 0.34a 4.49 ± 0.01e
45 A 4 2.98 ± 0.41b 4.44 ± 0.05e
45 B 4 3.49 ± 0.25a 4.56 ± 0.04e
15 A 7 2.77 ± 0.28b 4.77 ± 0.04d
15 B 7 3.32 ± 0.47a 4.68 ± 0.16e
30 A 7 2.49 ± 0.14b 4.82 ± 0.03d
30 B 7 3.31 ± 0.33a 4.50 ± 0.11e
45 A 7 3.44 ± 0.12a 4.43 ± 0.01e
45 B 7 3.47 ± 0.13a 4.50 ± 0.15e
15 A 14 2.34 ± 0.74b 4.89 ± 0.06d
15 B 14 2.76 ± 0.04b 4.68 ± 0.21e
30 A 14 2.61 ± 0.26b 4.77 ± 0.06d
30 B 14 2.83 ± 0.55b 4.83 ± 0.03d
45 A 1 2.82 ± 0.31b 4.82 ± 0.06d
45 B 14 2.93 ± 0.44b 4.77 ± 0.05d
Efecto Valor de p
CP 0.24 < 0.01
I < 0.01 < 0.01
T < 0.01 < 0.01
CP x I 0.12 < 0.01
CP x T 0.17 < 0.01
I x T 0.15 0.24
CP x I x T 0.57 0.09

A= Lactobacillus sp, aislado de desechos de mango.

B= Lactobacillus B2.

a,b,c,d,e: Medias en la misma columna con diferente superíndice presentan diferencia significativa (p<0.05).

El pH fue afectado significativamente por los factores principales, nivel de cáscara de piña (CP), inóculo (I) y tiempo de fermentación (T); confirmándose las interacciones CP x I y CP x T (Tabla 3). Las mezclas sin fermentar presentaron los valores más altos de pH y al aumentar el nivel de CP hubo un descenso de dicho parámetro (p<0.05). En los ensilados se observó que al aumentar la producción de ácido láctico el pH disminuyó significativamente, obteniéndose los mejores valores de pH entre los días 2 y 7 de fermentación (Tabla 3), lo cual se debe a que las BAL alcanzan la cima de la curva de crecimiento. Sin embargo, la interacción CP x I mostró que a los 7 días del proceso el pH de los tratamientos con 15 y 30% de CP e inoculados con Lactobacillus B2 fue mejor que con Lactobacillus sp, lo cual también se observó de forma similar a los 14 días en los ensilados con 15% de CP. El pH de los ensilados fue afectado por la interacción CP x T durante los 0, 7 y 15 días del proceso (p<0.05). Sin embargo, entre 2 y 4 días de fermentación los valores de pH de los ensilados no presentaron diferencias significativas, independientemente del nivel de CP y del tipo de inóculo (p<0.05). Los tratamientos con 30 y 45% de CP a los 14 días de fermentación mostraron un pequeño aumento en el pH, lo cual estuvo relacionado con un descenso de 0.72 unidades porcentuales en la producción de ácido láctico. El incremento del pH se debió al efecto amortiguador de las proteínas del pescado y péptidos derivados de su hidrólisis (Ramírez-Ramírez et al., 2008; Ghaly et al., 2013), así como también a la alta cantidad de cenizas que aportan los huesos de los desechos de pescado (Tablas 2 y 4), puesto que las sales de calcio actúan como neutralizantes del ácido láctico de los ensilados durante su almacenamiento (Land et al., 2017) .

Sin embargo, los ensilados obtenidos en este estudio presentaron características sensoriales aceptables y sin mostrar signos de descomposición. Los valores de pH de los ensilados de este estudio concuerdan con el de otros reportes (Castillo et al., 2019; Ramírez-Ramírez et al., 2018), aunque resultaron superiores al de 4.2 obtenido para ensilado biológico de residuos del fileteado de tilapia (Gerón et al., 2007) .

Composición química

En la Tabla 4 se muestran los resultados de la composición química y DIVMS de los ensilados obtenidos a los 14 días de fermentación. El contenido de materia seca (MS) disminuyó significativamente al aumentar el nivel de CP, por lo cual los ensilados con 45% de CP presentaron el contenido más bajo de MS, independientemente de la cepa inoculante (p<0.05). Los ensilados con 15% de CP presentaron los valores más altos de MS (39.3%), a pesar de tener en su formulación un alto contenido de desechos de pescado (57%), cuyo porcentaje de humedad es alto (Tablas 1, 2 y 4). Lo anterior seguramente se debió por la adición de 15% de rastrojo de maíz, lo que también mejoró la consistencia de los ensilados. Los resultados de MS obtenidos concuerdan con los de otros reportes (Geron et al., 2007; Castillo et al., 2019; Ramírez-Ramírez et al., 2018). El nivel de CP y la interacción CP x I fueron significativos en el contenido de cenizas. Los ensilados con 15% de CP e inoculados con Lactobacillus sp. presentaron el contenido más alto (14.5%) de cenizas (p<0.05), sin embargo, los demás tratamientos presentaron una buena concentración de minerales, debido a que los desechos de pescado son una fuente importante de esos nutrientes Tablas (1 y 4). El contenido de cenizas obtenido es similar a los resultados de otras investigaciones (Castillo et al., 2019; Ramírez-Ramírez et al., 2018), aunque fueron inferiores a 18.7% reportado por Geron et al. (2007).

Efecto del nivel de cáscara de piña e inóculo sobre la composición química proximal, fibra neutro detergente (FND), fibra ácido detergente (FAD) y digestibilidad <italic>in vitro</italic> de la materia seca (DIVMS) de los ensilados.
Cáscara de piña (CP) Inóculo (I) Materia seca (%) Cenizas (%) Proteína cruda (%) Extracto etéreo (%) FND (%) FAD (%) DIVMS (%)
15 A 39.6±0.7a 14.5±0.6a 27.5±1.5ab 6.0±0.7c 39.7±3.3a 22.1±0.9a 76.8±1.7b
30 A 35.1±0.5b 11.7± 0.3b 26.5±1.9b 5.2±0.6c 41.9±2.4a 22.7±1.7a 76.2 ±1.1b
45 A 28.5±1.3c 12.5± 0.5b 26.7±0.9b 5.7±0.5c 32.1±0.7b 17.9±1.6b 82.6±0.5a
15 B 39.0±1.4a 12.8±0.2b 29.7±0.8ab 8.0±1.0b 37.5±2.4a 21.6±2.0a 80.6±0.3a
30 B 33.5±0.5b 12.3± 1.4b 27.8±3.0ab 9.7±0.8a 35.7±1.6b 24.6±1.5a 84.4±3a
45 B 28.9±1.5c 12.9±0.7b 31.0±3.6a 10.0±0.8a 28.0±0.9c 18.4±0.8b 83.8±2.1a
Efecto valor de p
CP <0.01 0.01 0.369 0.021 <0.01 <0.01 0.03
Inóculo 0.26 0.51 .028 <0.01 <0.01 0.39 <0.01
CP x Inóculo 0.33 0.04 0.52 0.30 0.97 0.42 0.08

A= Lactobacillus sp., aislado de desechos de mango.

B= Lactobacillus B2.

a,b,c: Valores con letra distinta en cada columna difieren estadísticamente (p<0.05).

Los ensilados mostraron diferencia significativa en el contenido de proteína cruda debido al tipo de inóculo utilizado. Los ensilados con 45% de CP e inoculados con Lactobacillus B2 presentaron numéricamente el contenido de proteína cruda más alto (31%), pero estadísticamente el nivel de CP y el inóculo no produjeron cambios relevantes en la proteína cruda de los ensilados (Tabla 4). El contenido de proteína cruda de los ensilados obtenidos con 45% de CP y Lactobacillus B2 coincide con un 31.6% de ensilado biológico de desechos de tilapia (Geron et al., 2007), aunque fue superior a 28.08% de proteína cruda de ensilado biológico de desechos de pescado y mango (Ramírez-Ramírez et al., 2018); sin embargo, fue inferior a 35.42% reportado por Castillo et al. (2019) para ensilado biológico de residuos de pescado, melaza y yogurt. El extracto etéreo de los ensilados presentó diferencia significativa debido a los efectos principales. Al respecto, los tratamientos con 30 y 45% de CP e inoculados con Lactobacillus B2 mostraron el contenido más alto de lípidos (9.85%), lo cual es muy importante desde el punto de vista nutricional, ya que en ellos se encuentran ácidos grasos esenciales para la alimentación animal (Vidotti et al., 2011). Los resultados de extracto etéreo de este estudio son inferiores a los reportados por Geron et al. (2007) y Castillo et al. (2019); sin embargo, coinciden con los hallazgos de otro estudio (Ramírez-Ramírez et al., 2018). Los contenidos de FND y FAD disminuyeron al aumentar el nivel de CP. Aunque la CP es una buena fuente de fibra (Tabla 1), la tendencia en los resultados se debió a la adición de rastrojo de maíz en la fórmula, ya que los ensilados con mayor contenido de CP a la vez contenían menor cantidad de rastrojo de maíz y por tanto menos contenido de FND y FAD (Tablas 2 y 4). En ese sentido, los resultados son muy importantes, ya que los contenidos de FND y FAD en los forrajes están correlacionados negativamente con el consumo y la digestibilidad. Los porcentajes de FND y FAD obtenidos en los ensilados del presente estudio fueron superiores a los reportados por Ramírez-Ramírez et al. (2018).

Digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS)

Los valores de digestibilidad de componentes alimenticios son parámetros importantes para evaluar la formulación de las dietas y para determinar la utilización de un componente alimenticio (Ozyurt et al., 2017). Los valores de DIVMS de los ensilados presentaron un rango de 76.2 a 84.4% con diferencias significativas entre tratamientos debido a los efectos principales (p<0.05). Al aumentar el nivel de CP a 45% y con la adición de Lactobacillus sp., los ensilados presentaron un incrementó de 6.1 unidades porcentuales en la DIVMS para alcanzar 82.6% (p<0.05). Sin embargo, ese resultado fue estadísticamente igual al utilizar Lactobacillus B2, independientemente del nivel de CP (Tabla 4). En la producción de ensilado de pescado, las proteasas presentes en el medio ácido hidrolizan las proteínas en fragmentos más pequeñas, péptidos y aminoácidos, lo cual afecta a la digestibilidad total (Ghaly et al., 2013; Geron et al., 2007; Ramírez-Ramírez et al., 2016; Olsen y Toppe, 2017). El efecto del nivel de CP sobre el aumento en la DIVMS se debió probablemente a un aumento en la disponibilidad de nutrientes, lo cual estuvo relacionado con el descenso en las fracciones de fibra y por consecuencia incrementó la actividad microbiana ruminal. Así mismo, la adición de CP probablemente aumentó la actividad de la pepsina utilizada en el segundo paso de la prueba de digestibilidad, lo cual simula la digestión estomacal y por tanto la DIVMS de los ensilados aumentó. Las BAL son mejor conocidas como cultivos iniciadores debido a sus características metabólicas versátiles tales como actividad acidificante, actividad proteolítica y síntesis de bacteriocinas (Jini et al., 2011). En general, la DIVMS de los ensilados fue mayor con Lactobacillus B2 que con Lactobacillus sp., debido al mejor poder acidificante de Lactobacillus B2 y probablemente a una alta capacidad productora de enzimas digestivas. Los resultados de DIVMS obtenidos en este trabajo concuerdan con los de otros reportes (Ozyurt et al., 2017; Ramírez-Ramírez et al., 2018).

 CONCLUSIONES

La inclusión de cáscara de piña en un 15 y 30% y Lactobacillus B2 causó la mejor acidificación de los ensilados a 7 días de fermentación. Sin embargo, a los 14 días todos los ensilados fueron estables y presentaron alto contenido de nutrientes. Además, el uso de Lactobacillus B2, independientemente del nivel de cáscara de piña produjo la más alta DIVMS de los ensilados. La producción de ensilados con desechos de pescado y cáscara de piña en combinación con melaza y rastrojo de maíz es una alternativa tecnológica sencilla, económica y amigable con el ambiente. Se recomienda realizar el escalamiento del proceso de producción y evaluar los ensilados en la alimentación de rumiantes.

 AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la asistencia técnica del MVZ Francisco Arce Romero, Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nayarit, México.

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Clave:2020-62.

 Original Article Use of fish waste and pineapple peel to produce biological silage ABSTRACT

Six treatments were formulated to make silages with fish wastes, corn stubble, molasses, pineapple peel (PP) [15, 30 and 45%] and inoculum Lactobacillus sp. or Lactobacillus B2. The silages of each treatment were made in triplicate and incubated at 30 °C for 0, 2, 4, 7 and 14 days in order to evaluate the acidification under a 3 x 2 x 5 factorial design. The chemical composition and in vitro dry matter digestibility (IVDMD) were determined to the silages at end of fermentation. The highest acidification (p<0.05) was presented in the treatments with PP 15 and 30% and Lactobacillus B2 for 7 days. The highest dry matter content (39.3%) (p<0.05) was obtained with 15% of PP and the crude protein was from 26.5 to 31% without significant difference. The highest concentration of lipids (9.85%) was present in the treatments with PP 30 and 45% and Lactobacillus B2. Detergent fiber fractions decreased with increasing PP level and the highest IVDMD (82.9%) occurred in silages when using Lactobacillus B2, regardless of PP level. The silages obtained are an alternative in ruminant feeding.

 Keywords: Fish waste pineapple peel biological silage ruminant feeding INTRODUCTION

World fisheries production in 2016 reached approximately 171 million tons, of which aquaculture accounted for 47% of the total and fishing for 53%, not including what was destined for the production of fishmeal and fish oil (FAO, 2018). More than 60% of residues made up of fins, scales, heads, viscera, skeleton, skin, roe and remains of meat derive from the industrial processing of fish (Ghosh et al., 2016; Renuka et al., 2016). These wastes in many parts of the world are discarded, which causes a great loss of nutrients such as proteins, lipids and minerals, in addition to polluting the environment (Olsen and Toppe, 2017). With fish waste, fertilizers, concentrates and protein hydrolysates, as well as fish meal and oil can be produced (Renuka et al., 2016; Ozyurt et al., 2017). Biotechnologies have also been developed for the fish waste conversion into high-value products such as polyunsaturated fatty acids, physiologically important peptides, carbohydrates and other bioactive compounds (Ghaly et al., 2013; Smichi et al., 2016). However, most of these technologies are not economically attractive because they require high investment (Ozyurt et al., 2017). The most important input in animal production is fishmeal due to its high protein content, but due to its high cost, alternative sources of protein are demanded in the market (Castillo et al., 2019). Fish silage is a product resulting from the preservation of whole fish or parts by the addition of organic or inorganic acids (chemical silage) or by bacterial fermentation (biological silage) (Ghaly et al., 2013; Olsen and Toppe, 2017). The fish silage produced by the biological method is a viable technological alternative from the economic and environmental point of view, which consists of mixing the ground fish waste with molasses or another carbohydrate source and a starter culture of lactic acid bacteria (LAB ) (Ramírez-Ramírez et al., 2018; Castillo et al., 2019). During fermentation, LABs increase the production of acids, mainly lactic, so the pH decreases and microbial deterioration slows down. Furthermore, fish proteases are activated, accelerating proteolysis and consequently the digestibility of the product increases (Ghaly et al., 2013). Likewise, LABs generate compounds such as bacteriocins and hydrogen peroxide that help preservation and diacetyl, an aroma and flavor enhancing substance (Jini et al., 2011). In this sense, to achieve control of fermentation, the selection of LAB strains is important. According to various studies, fish silage is an excellent source of proteins, lipids and minerals with great biological properties for animal feed (Geron et al., 2007; Ghaly et al., 2013; Ramírez-Ramírez et al., 2016; Land et al., 2017), in addition, biological fish silage has antibacterial and antioxidant benefits and it is a possible source of probiotics (Jini et al., 2011; Ozyurt et al., 2017). On the other hand, pineapple (Annanas comosus Merr.) Ranks third as the most popular and most economically important fruit in the world, with a production of 24'785,762 tons (FAOSTAT, 2018). From pineapple industrialization, approximately 75% of the weight of the fruit is obtained as waste, which is a valuable fiber source, soluble sugars, protein, ascorbic acid, vitamins, minerals, water and bioactive compounds such as bromelain from multiple applications (Damasceno et al., 2016; Ketnawa et al., 2012). Pineapple waste can be used as a good quality substrate for microorganisms in fermentation processes; however, they are often thrown away causing serious contamination problems (Ketnawa et al., 2012). For all the above, the use of fish and pineapple waste could be a viable and relevant alternative from an economic and environmental point of view. To our knowledge there are no reports on the use of fish waste and pineapple peel together. Therefore, the objective of this research was to evaluate the use of these industrial wastes in the silage production by lactic fermentation.

MATERIAL AND METHODS

Raw material preparation

Fish waste and pineapple peel

Fish waste was obtained from commercial marine species such as Bagre panamensis, Peprilus snyderi, Sphyraena ensis, Trachynotus ovatus, Argyrosomus regius, Diplodus vulgaris and Bagre panamensis (estuarine fish) from San Blas port, Nayarit, Mexico. The waste was processed in a meat mill (Torrey Brand, model 32-3, Mexico) using the 0.5 cm diameter sieve and stored at -20 °C until use. The peel of pineapple (Annanas comosus Merr.), Cayenne smooth variety, was obtained manually with a knife and homogeneously ground in a food processor. The following table shows the chemical composition of these ingredients.

Chemical composition (% DM) of fish waste and pineapple peel.
Component Fish waste Pineapple peel
Dry matter 29.72 ± 0.4 23.22 ± 0.37
Ash 18.94 ± 0.52 4.11 ± 0.12
Crude protein (Nt x 6.25) 52.43 ± 0.92 4.31 ± 0.13
Ethereal extract 24.50 ± 0.67 3.38 ± 0.46
Crude fiber --- 13.95 ± 0.55
Neutral detergent fiber --- 41.60 ± 1.10
Detergent acid fiber --- 22.71 ± 0.73
ELN 4.13 74.25

Mean ± standard deviation, n = 3.

ELN = 100 -% ash -% crude protein -% lipids -% crude fiber.

Cane molasses and corn stubble

Cane molasses with a moisture content of 25.15%, 10.37% ash and 55.73% total soluble carbohydrates was used. To improve the consistency of the silages, corn stubble processed in a knife mill was added using the 2 mm sieve (Willey, model 4, Philadelphia, USA).

Inoculums

Lactobacillus B2 and Lactobacillus sp. strains were evaluated, the latter being isolated from mango waste in our laboratory. The initiators were cultured in MRS broth (from Man Rogosa and Sharpe, MRS, Merck Darmstadt) at 30 °C for 24 h until a final concentration of 1 X 109 cfu/mL was recorded.

Silage production

Six treatments were prepared with different amounts in percentage proportion of fish waste, PP (15, 30 and 45%, w/w), corn stubble, and sugar cane molasses (9%, w/w). As inoculum (I) Lactobacillus sp. or Lactobacillus B2 at 4% (v/p) (Table 2). The mixtures obtained were used to make 100 g mini silos in black plastic bags. Each treatment was prepared in triplicate and the silos were vacuum sealed and incubated at 30 ° C for 14 days.

Percentage composition of ingredients used in the production of silage by lactic acid fermentation.
Ingredient Porcentage
Fish waste 57 47 37 57 47 37
Pineapple peel 15 30 45 15 30 45
Molasses 9 9 9 9 9 9
Corn stubble 15 10 5 15 10 5
Inoculum 4A 4A 4A 4B 4B 4B

A = Lactobacillus sp isolated from mango waste.

B = Lactobacillus B2.

Chemical analysis

The silages were analyzed every 0, 2, 4, 7 and 14 days (T) to determine the pH with a potentiometer model UB10 Ultra Basic (Denver Instrument, USA) and the content of lactic acid by titration. The silages obtained at the end of fermentation were analyzed to determine their proximal chemical composition (AOAC, 2005) and the contents of neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) by the method of Van Soest et al. (1991).

In Vitro Digestibility of Dry Matter (IVDMD)

IVDMD was determined following the two-step technique of Tilley and Terry (1963). The silage samples were dried at 70 °C for 24 h in a forced air oven and processed in a Wiley mill to a particle size of 1 mm. Two uncastrated Blackbelly sheep weighing 35 kg of body weight and equipped with a cannula in the rumen were used to collect the ruminal fluid. The sheep were fed a diet based on 25% corn silage, 25% alfalfa and 50% concentrate. In the second step of the IVDMD technique, pepsin (Sigma P-7012, Sigma) was used.

Statistical analysis

The data of the fermentation parameters were treated by analysis of variance (ANDEVA) for a factorial design 3 x 2 x 5 (level of pineapple peel x inoculum x fermentation time). The data obtained from the chemical composition and IVDMD were analyzed by ANDEVA for a 3 x 2 factorial design (level of pineapple peel x inoculum).

When a significant difference was found, the means of the treatments were compared with the Tukey test (p <0.05). The analysis was done with the Statistica 7 program (Statistica, versión 7.1).

RESULTS AND DISCUSSION

Fermentative parameters

The silage lactic acid content showed significant differences between treatments due to the inoculum factors (I) and fermentation time (T) (Table 3). The unfermented mixtures presented the lowest lactic acid content (average 0.55 ± 0.15%) with no difference between these treatments (p> 0.05). However, between days 2 and 7 of the process, most of the treatments with Lactobacillus B2 presented the maximum concentration of lactic acid (average 3.42 ± 0.17%). The high acidifying power of Lactobacillus B2 has been previously reported (Ramírez-Ramírez et al., 2008; 2018) and in this work it is reaffirmed. The results obtained agree with values of 2.96 to 4.42% of lactic acid recently reported for biological silage added with mixtures of fish and mango waste (Ramírez-Ramírez et al., 2018), as well as with the values of 2.96 and 3.08% of lactic acid for fermented shrimp head silage and fish waste; respectively (Castillo et al., 2019).

The pH was significantly affected by the main factors, pineapple peel level (PP), inoculum (I) and fermentation time (T); confirming the PP x I and PP x T interactions (Table 3). The unfermented mixtures presented the highest pH values and when the PP level increased there was a decrease in this parameter (p <0.05). In silages, it was observed that when the lactic acid production increased, the pH decreased significantly, obtaining the best pH values between days 2 and 7 of fermentation (Table 3), which is due to the fact that LAB reaches the growth curve top. However, the PP x I interaction showed that at 7 days of the process the pH of the treatments with 15 and 30% of PP and inoculated with Lactobacillus B2 was better than with Lactobacillus sp, which was also observed in a similar way to the 14 days in silage with 15% PP. The silage pH was affected by the PP x T interaction during the 0, 7 and 15 days of the process (p <0.05). However, between 2 and 4 days of fermentation, the pH values of the silages did not show significant differences, regardless of PP level and inoculum type (p <0.05). The treatments with 30 and 45% PP at 14 days of fermentation showed a small increase in pH, which was related to a decrease of 0.72 percentage units in the lactic acid production. The increase in pH was due to the buffering effect of fish proteins and peptides derived from their hydrolysis (Ramírez-Ramírez et al., 2008; Ghaly et al., 2013), as well as the high amount of ashes provided by the bones from fish waste (Tables 2 and 4), since calcium salts act as neutralizers of lactic acid in silage during storage (Land et al., 2017).

Effect of pineapple peel level, inoculum and fermentation time on the lactic acid content and pH of the silage.
Pineapple peel level (PP) (%) Inoculum (I) Fermentation time (T) (days) Lactic acid (%) pH
15 A 0 0.49 ± 0.08c 6.09 ± 0.05a
15 B 0 0.43 ± 0.01c 6.05 ± 0.14a
30 A 0 0.55 ± 0.02c 5.83 ± 0.01b
30 B 0 0.73 ± 0.03c 5.60 ± 0.10c
45 A 0 0.37 ± 0.14c 5.44 ± 0.25c
45 B 0 0.72 ± 0.07c 5.32 ± 0.28c
15 A 2 2.97 ± 0.45b 4.62 ± 0.03e
15 B 2 3.37 ± 0.05a 4.65 ± 0.07e
30 A 2 2.71 ± 0.25b 4.64 ± 0.05e
30 B 2 3.32 ± 0.21a 4.52 ± 0.05e
45 A 2 2.98 ± 0.41b 4.36 ± 0.09e
45 B 2 3.14 ± 0.15ab 4.51 ± 0.05e
15 A 4 3.09 ± 0.61ab 4.69 ± 0.15de
15 B 4 3.57 ± 0.06a 4.63 ± 0.04e
30 A 4 2.78 ± 0.14b 4.65 ± 0.03e
30 B 4 3.79 ± 0.34a 4.49 ± 0.01e
45 A 4 2.98 ± 0.41b 4.44 ± 0.05e
45 B 4 3.49 ± 0.25a 4.56 ± 0.04e
15 A 7 2.77 ± 0.28b 4.77 ± 0.04d
15 B 7 3.32 ± 0.47a 4.68 ± 0.16e
30 A 7 2.49 ± 0.14b 4.82 ± 0.03d
30 B 7 3.31 ± 0.33a 4.50 ± 0.11e
45 A 7 3.44 ± 0.12a 4.43 ± 0.01e
45 B 7 3.47 ± 0.13a 4.50 ± 0.15e
15 A 14 2.34 ± 0.74b 4.89 ± 0.06d
15 B 14 2.76 ± 0.04b 4.68 ± 0.21e
30 A 14 2.61 ± 0.26b 4.77 ± 0.06d
30 B 14 2.83 ± 0.55b 4.83 ± 0.03d
45 A 1 2.82 ± 0.31b 4.82 ± 0.06d
45 B 14 2.93 ± 0.44b 4.77 ± 0.05d
Effect P Value
CP 0.24 < 0.01
I < 0.01 < 0.01
T < 0.01 < 0.01
CP x I 0.12 < 0.01
CP x T 0.17 < 0.01
I x T 0.15 0.24
CP x I x T 0.57 0.09

A = Lactobacillus sp, isolated from mango waste.

B = Lactobacillus B2.

a, b, c, d, e: Means in the same column with a different superscript show a significant difference (p <0.05).

However, the silage obtained in this study presented acceptable sensory characteristics and did not show signs of decomposition. The pH values of this study silages agree with those of other reports (Castillo et al., 2019; Ramírez-Ramírez et al., 2018), although they were higher than the 4.2 obtained for biological silage from residues of tilapia filleting (Gerón et al., 2007).

Chemical composition

Table 4 shows the results of the chemical composition and IVDMD of the silages obtained after 14 days of fermentation. The dry matter content (DM) decreased significantly when the PP level increased, therefore the silages with 45% PP presented the lowest DM content, regardless of the inoculating strain (p <0.05). The silages with 15% PP presented the highest DM values (39.3%), despite having a high content of fish waste (57%) in their formulation, whose moisture percentage is high (Tables 1, 2 and 4). This was probably due to the addition of 15% corn stubble, which also improved the silage consistency. The DM results obtained agree with those of other reports (Geron et al., 2007; Castillo et al., 2019; Ramírez-Ramírez et al., 2018). The PP level and the PP x I interaction were significant in the ash content. The silages with 15% PP and inoculated with Lactobacillus sp. presented the highest ash content (14.5%) (p <0.05), however, the other treatments presented a good concentration of minerals, because fish waste is an important source of these nutrients Tables (1 and 4). The ash content obtained is similar to other investigation results (Castillo et al., 2019; Ramírez-Ramírez et al., 2018), although they were lower than 18.7% reported by Geron et al. (2007).

Effect of pineapple peel level and inoculum on the proximal chemical composition, neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF) and <italic>in vitro</italic> dry matter digestibility (IVDMD) of the silage
Pineapple peel (PP) Inoculum (I) Dry matter (%) Ashes (%) Crude protein (%) Ethereal extract (%) NDF (%) ADF (%) IVDMD (%)
15 A 39.6±0.7a 14.5±0.6a 27.5±1.5ab 6.0±0.7c 39.7±3.3a 22.1±0.9a 76.8±1.7b
30 A 35.1±0.5b 11.7± 0.3b 26.5±1.9b 5.2±0.6c 41.9±2.4a 22.7±1.7a 76.2 ±1.1b
45 A 28.5±1.3c 12.5± 0.5b 26.7±0.9b 5.7±0.5c 32.1±0.7b 17.9±1.6b 82.6±0.5a
15 B 39.0±1.4a 12.8±0.2b 29.7±0.8ab 8.0±1.0b 37.5±2.4a 21.6±2.0a 80.6±0.3a
30 B 33.5±0.5b 12.3± 1.4b 27.8±3.0ab 9.7±0.8a 35.7±1.6b 24.6±1.5a 84.4±3a
45 B 28.9±1.5c 12.9±0.7b 31.0±3.6a 10.0±0.8a 28.0±0.9c 18.4±0.8b 83.8±2.1a
Effect p value
PP <0.01 0.01 0.369 0.021 <0.01 <0.01 0.03
Inoculum 0.26 0.51 .028 <0.01 <0.01 0.39 <0.01
PP x Inoculum 0.33 0.04 0.52 0.30 0.97 0.42 0.08

A = Lactobacillus sp., Isolated from mango waste.

B = Lactobacillus B2.

a, b, c: Values with different letters in each column differ statistically (p <0.05).

The silages showed a significant difference in the crude protein content due to the type of inoculum used. The silages with 45% PP and inoculated with Lactobacillus B2 presented numerically the highest crude protein content (31%), but statistically the PP level and the inoculum did not produce relevant changes in silage crude protein (Table 4). The crude protein content of silages obtained with 45% PP and Lactobacillus B2 coincides with 31.6% of biological silage from tilapia waste (Geron et al., 2007), although it was higher than 28.08% of crude protein from biological silage of fish and mango waste (Ramírez-Ramírez et al., 2018); however, it was lower than the 35.42% reported by Castillo et al. (2019) for biological silage of fish waste, molasses and yogurt.

Silage ethereal extract showed a significant difference due to the main effects. In this regard, treatments with 30 and 45% PP and inoculated with Lactobacillus B2 showed the highest lipid content (9.85%), which is very important from a nutritional point of view, since essential fatty acids are found in them for animal feed (Vidotti et al., 2011). The ethereal extract results of this study are lower than those reported by Geron et al. (2007) y Castillo et al. (2019); however, they coincide with the findings of another study (Ramírez-Ramírez et al., 2018). The NDF and ADF contents decreased with increasing PP level. Although PP is a good source of fiber (Table 1), the trend in the results was due to the addition of corn stubble in the formula, since the silages with a higher PP content at the same time contained a lower amount of corn stubble and therefore less NDF and ADF content (Tables 2 and 4). In this sense, the results are very important, since the contents of NDF and ADF in forages are negatively correlated with consumption and digestibility. The percentages of NDF and ADF obtained in the silages of the present study were higher than those reported by Ramírez-Ramírez et al. (2018).

In Vitro Digestibility of Dry Matter (IVDMD)

The digestibility values of food components are important parameters to evaluate the formulation of diets and to determine the use of a food component (Ozyurt et al., 2017). The IVDMD values of the silages presented a range of 76.2 to 84.4% with significant differences between treatments due to the main effects (p <0.05). By increasing the PP level to 45% and with the addition of Lactobacillus sp., the silages presented an increase of 6.1 percentage units in the IVDMD to reach 82.6% (p <0.05). However, this result was statistically the same when using Lactobacillus B2, regardless of PP level (Table 4). In fish silage production, the proteases present in the acidic medium hydrolyze the proteins into smaller fragments, peptides and amino acids, which affects the total digestibility (Ghaly et al., 2013; Geron et al., 2007; Ramírez-Ramírez et al., 2016; Olsen and Toppe, 2017). The PP effect on the increase in IVDMD was probably due to an increase in nutrient availability, which was related to the decrease in fiber fractions and consequently increased ruminal microbial activity. Likewise, the addition of PP probably increased the activity of the pepsin used in the second step of the digestibility test, which simulates stomach digestion and therefore the IVDMD of the silages increased. LABs are better known as starter cultures due to their versatile metabolic characteristics such as acidifying activity, proteolytic activity, and bacteriocin synthesis (Jini et al., 2011). In general, IVDMD of the silages was higher with Lactobacillus B2 than with Lactobacillus sp., due to the better acidifying power of Lactobacillus B2 and probably to a high production capacity of digestive enzymes. The IVDMD results obtained in this work agree with those of other reports (Ozyurt et al., 2017; Ramírez-Ramírez et al., 2018).

CONCLUSIONS

The inclusion of pineapple peel in 15 and 30% and Lactobacillus B2 caused the best acidification of silages at 7 days of fermentation. However, at 14 days all silages were stable and presented high nutrient content. Furthermore, the use of Lactobacillus B2, regardless of pineapple peel level produced the highest IVDMD of the silages. Silage production with fish waste and pineapple peel in combination with molasses and corn stubble is a simple, economical and environmentally friendly technological alternative. It is recommended to scale up the production process and evaluate the silage in ruminant feeding.