avAbanico veterinarioAbanico vet2007-428X2448-6132Sergio Martínez González10.21929/abavet2020.800501Notas cortasEstudio exploratorio de la genotoxicidad de vacunas recombinantes para tuberculosis bovinaRamos-IbarraMaría1Villa-CastellanosJosé1Barba-LeónJeannette2Flores-ValdezMario3Zavala-AguirreLuis4Torres BugarínOlivia**5Laboratorio de Toxicología Genética. Departamento, Salud pública, División Ciencias Veterinarias, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara. México. Universidad de GuadalajaraUniversidad de GuadalajaraMexicoLaboratorio de Caracterización Molecular de Patógenos. Departamento de Salud Pública, División Ciencias Veterinarias, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara. México. Universidad de GuadalajaraUniversidad de GuadalajaraMexicoBiotecnología Médica y Farmacéutica Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. México. Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C.MéxicoLaboratorio de Hidrobiología y Ecotoxicología Acuática, Dirección Departamental de Biotecnología y Ambientales, Universidad Autónoma de Guadalajara. México. Universidad Autonoma de GuadalajaraUniversidad Autónoma de GuadalajaraMexicoMéxicoLaboratorio de Evaluación de Genotóxicos, Programa Internacional de Medicina, Universidad Autónoma de Guadalajara. México. Universidad Autonoma de GuadalajaraUniversidad Autónoma de GuadalajaraMexico**Autor Responsable Ramos-Ibarra María y Correspondiente Torres-Bugarín Olivia. Laboratorio de Evaluación de Genotóxicos, Programa Internacional de Medicina, Universidad Autónoma de Guadalajara, Av. Patria 1201. Lomas del Valle, CP 45129, Zapopan, Jalisco, México, Apartado Postal 1-440. Tel: (33) 36488824; Ext. 33152. maluisaramos@hotmail.com, chavavilla06@gmail.com, jeannbarba@gmail.com , floresv@ciatej.mx, jzavala@edu.uag.mx, oliviatorres@hotmail.com28022021Jan-Dec202010e5011501201901052020Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsRESUMEN:
La vacuna BCG (bacilo Calmette-Guérin) para el control de la tuberculosis bovina tiene eficacia variable y se requiere la generación y prueba de nuevas vacunas. Por ello se realizó un estudio exploratorio para evaluar la genotoxicidad de dos potenciales vacunas, recombinantes antituberculosa bovina en becerras Holstein Freisan de edad promedio de 9 meses, mediante eritrocitos micronucleados (EMN). Se formaron 5 grupos: 1) Solución salina, 2) El vector pVAX1 (Vector sin inserto), CV), 3) Vacuna Micobacterium bovis (M. bovis) tipo 1 (PE11 [VR1]), 4) Vacuna M. bovis tipo 2 (PPE68 [VR2]), 5) Ambas vacunas (VR1+VR2). A cada organismo se le tomaron 5 muestras de sangre: la primera previa al tratamiento, de la segunda a la cuarta muestra cada 24 horas y la 5ta a los 90 días postratamiento. Las muestras se analizaron con microscopía y se contabilizaron EMN/10,000 eritrocitos. Frecuencias de EMN disminuyeron con la edad (Kruskall Wallis, 95%). Al analizar los tratamientos con respecto al control se identificó menor valor de EMN en los grupos VR2 y en VR1+VR2 (P=0.02). Estos resultados, aparentan efecto citoprotector, no obstante, podría tratarse de efecto mielosupresor (citotóxico) enmascarado, ya que la frecuencia de EMN disminuye al haber mielodepresión. Para confirmar citotoxicidad se sugiere continuar el estudio en organismos más jóvenes.
Palabras clave:Genotoxicidadmicronúcleosbovinos y vacuna recombinante antituberculosaINTRODUCCIÓN
La Organización Mundial de la Salud señala que la tuberculosis bovina es una enfermedad infecto-contagiosa bacteriana crónica, zoonótica de alta morbilidad y mortalidad y es endémica de países en desarrollo; específicamente en México, tiene prevalencia en todo el país (OIE, 2020; PRONABIVE, 2015), donde es probable que se favorezca la transmisión natural en el ganado (Van der Heijden et al., 2017). La enfermedad produce grandes pérdidas económicas a causa de la disminución de la población de bovinos y leche; por ello precisa de constante control y prevención (Flores, 2012; Gooding y Brook, 2014; Ortíz, 2015; OIE, 2020). Mycobacterium bovis (M. bovis) y M. tuberculosis son la causa de la tuberculosis. Esta enfermedad forma nódulos o tubérculos en los ganglios linfáticos y diversos tejidos, de donde surge su nombre (Carriosa et al., 2015; Martínez et al., 2019).
Los signos clínicos pueden ser subagudos o crónicos; la tasa progresiva es variable, en algunos animales la bacteria se queda latente o tarda años en manifestarse; mientras que en otros pueden ser afectados gravemente en poco tiempo, y por ello es que debe notificarse de acuerdo al Código Sanitario para animales terrestres (OIE, 2020). Se transmite por contacto con individuos o tejidos infectados, por ingestión de alimentos o fluidos corporales contaminados (OIE, 2020; Herrera et al., 2008; Higareda-de Sales et al., 2015; Himsworth et al., 2010; Grange, 2001).
Una propuesta para erradicar la enfermedad es la vacunación, cuyo objetivo es mejorar la respuesta inmune frente a la tuberculosis, reducir la incidencia de la enfermedad activa; además de protección más duradera, mayor eficacia y seguridad, aplicabilidad a cualquier población y compatibilidad con el resto del calendario de vacunación; así como bajo costo (Barba et al., 2013).
Por su parte la prueba de micronúcleos (MN), detecta pérdida de fragmentos o cromosomas completos durante la mitosis, y en sangre periférica es una excelente herramienta económica, altamente sensible e informativa que no requiere de tamaños de muestra grandes para evaluar el posible daño al DNA. Además los modelos in vivo, tienen la característica de transformar sustancias donde se ha descrito que muchos de sus metabolitos pueden llegar a ser más tóxicos, que el compuesto original; así como también se puede evaluar la respuesta inmune por medio de activación de la médula ósea o mielosupresión (Cristaldi, 2004; Cedano et al., 2012; Torres-Bugarín et al., 2015; Castañeda et al., 2016).
Desde hace más de 100 años se ha utilizado la vacuna BCG (bacilo de Calmette-Guérin), derivada de una cepa atenuada de M. bovis; denominada bacilo de Calmette-Guérin, para la prevención de la tuberculosis bovina; dicha vacuna tiene eficacia variable (Cordero et al., 2013). Por ello es prioritario trabajar en la generación de nuevas vacunas, con base en los nuevos conocimientos sobre el genoma de M. tuberculosis y M. bovis, en conjunto con su respuesta inmunitaria (Cordero et al., 2013; Van der Heijden et al., 2017).
Nuevas estrategias en la generación de vacunas, cómo las del tipo de ADN, son herramientas susceptibles de evaluación y explotación para la prevención de la tuberculosis bovina. A este respecto, está descrito que los bovinos vacunados con una variante de ADN recombinante (ADNr), que codifica para los antígenos 85B, MPT64 y MPT83, mejoraron la respuesta inmune, y disminuyeron la carga de antígenos. Por lo anterior, Barba, et al., (2013) evaluaron la efectividad de vacunas de ADNr utilizando otro tipo de antígenos de M. bovis; para ello clonaron los genes que codifican para las proteínas PE11 y PPE68, en el vector de expresión eucariótico pVAX1. Para ello construyeron la vacuna de ADN, basada en un vector de expresión eucariota (pVAX1, Invitrogen, EE. UU.), de donde produjeron PE11 y PPE68 proteínas codificadas en un gen presente en RD1, una región ausente de M. bovis BCG, una cepa comúnmente utilizada como vacuna en humanos y en modelos bovinos experimentales.
Esta cepa contribuye a la reactividad cruzada y la confusión entre los animales vacunados e infectados, cuando se prueba. Usaron pVAX1-PPE68 y PE11 para vacunar Bovinos Holstein, y determinar su capacidad para inducir la producción de IFN-g in vitro, así como para generar anticuerpos en animales vacunados.
RD1 es una sección de ADN de 9.5 kb llamada región de deleción 1, está presente en las cepas virulentas de M. tuberculosis, pero se elimina en todas las cepas atenuadas de la vacuna M. bovis BCG. Esta región codifica al menos nueve genes. Algunos o todos los productos del gen RD1 pueden estar involucrados en la virulencia y la patogénesis (Daugelat, et al., 2003).
Si bien es necesario la construcción de nuevas vacunas, también es indispensable que estos nuevos tratamientos pasen por un proceso de evaluación, tanto de su eficacia terapéutica, como en posibles efectos tóxicos o genotóxicos, a corto o largo plazo.
Por tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar en becerras Holstein Friesian (Bos taurus), la genotoxicidad de vacunas recombinantes antituberculosa desarrolladas por Barba et al., (2013).
MATERIAL Y MÉTODOSTipo de estudio
Experimental, observacional, longitudinal, comparativo. Con número de registro CINV.020/15 ante la Coordinación de Investigación del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara, Jalisco, México.
Organismos
Se trabajó con 13 becerras Holstein Friesian (Bos taurus) sanas, con edad promedio de 9 meses, del rancho de Producción Cofradía, Universidad de Guadalajara, Jalisco, México.
En investigación biomédica, trabajar con animales de uso poco común, representa dificultades, como: el tamaño y número ideal de animales, así como la manutención y cuidado. Como lo señala la OCDE, los bovinos son una especie de uso poco común en investigación biomédica; por ética, metodología y alto costo se debe respetar el principio de utilizar el mínimo número de animales. En el caso particular donde se realizó el estudio, no fue posible utilizar el número ideal de becerras, por la logística del cuidado, alojamiento y alimentación (OCDE, 1999).
Grupos de estudio
Se formaron 5 grupos, a los que se les administró una dosis de 1.0 mL vía intramuscular, de uno de los siguientes compuestos:
Grupo 1) [n=3] Control Solución salina estéril al 0.9% (p/v) (CSS).
Grupo 2) [n=2] Control Vector sin inserto pVAX1(CV).
Grupo 3) [n=3] Vacuna recombinante codificada para PE11: 0.5 mg/mL de plásmido M. bovis (VR1).
Grupo 4) [n=3] Vacuna recombinante codificada para PPE68: 0.5 mg/mL de plásmido M. bovis (VR2).
Grupo 5) [n=2] VR1+VR2 (PE11: 0.25 mg/mL+PPE68:0.25 mg/mL).
Este vector fue diseñado de acuerdo con las pautas de la FDA, las secuencias de DNA eucariotas se limitan a las requeridas para la expresión con el fin de minimizar la posibilidad de integración cromosómica (Barba et al., 2013).
Preparación de las vacunas PE11 y PPE68
Éstas se prepararon en el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), donde se amplificaron las regiones codificantes de los genes PE11 y PPE68, a partir de DNA genómico de M. bovis; mediante reacción en cadena de la polimerasa con oligonucléotidos, específicos y diseñados expresamente para este proyecto. La identidad y fidelidad de la secuencia amplificada se verificó por restricción con las endonucleasas tipo II (XbaI y HindIII) y secuenciación. Luego éstos se insertaron en el vector de expresión eucariótico pVAX1. El ADN plasmídico se purificó por medio de un kit comercial Quiagen Plasmid Plus Midi (Barba et al., 2013).
Proteínas PE11 y PPE68
Estas familias de proteínas de estructura globular son las que confieren mayor variabilidad a M. tuberculosis. La proteína PE11 (motivos Prolina-Ácido Glutámico a nivel del extremo N-terminal), se caracterizan por ser rica en prolina y ácido glutámico, y la proteína PPE68 (prolina, prolina, ácido glutámico) se define por repetidos en tándem (MPTRs) (Fontalvo Rivera y Gómez Camargo, 2015).
Generación de vacuna recombinantes
Los plásmidos recombinantes transformados en Escherichia coli DH5α, y que contenían a las proteínas PE11 o PPE68, fueron obtenidos por medio del kit comercial Quiagen Plasmid Plus Maxi kit, y se mezclaron con solución salina isotónica (SSI); hasta ajustar a un volumen de 0.5 mL, con concentración de 500 µg/mL (vacuna administrada). Se amplificaron mediante PCR los genes PE11 y PPE68, con la ayuda de la enzima Phusion de alta fidelidad (Finnizymes, EE. UU.) y el DNA genómico AN5 de M. bovis como plantilla, y el par de cebadores MbPPE68-5FH3 (5´- GGAGAAGCTTGTCACCATGCTGTGG-3) + MbPPE683RXb3RXb (5´- GATCCGCTCTAGATTACCTGCCTCCTG-3´).
Barba y sus colaboradores (Barba 2013)et al.,2013
Toma y procesamiento de muestras
A cada becerra se le tomaron 5 muestras de sangre periférica, la primera previa al tratamiento; de la 2da a la 4ta cada 24 horas, y la última a los 90 días posteriores. La toma de muestra se realizó de la yugular, mediante punción con aguja número 18 y se realizaron dos frotis por muestra, los cuales se dejaron secar al aire libre y se fijaron en etanol al 96% por 10 minutos. El segundo frotis fue con finalidades de respaldo. Posteriormente se tiñeron con naranja de acridina, tinción específica para ácidos nucleicos (Hayashi, 1990) y se resguardaron hasta su análisis en cajas para mantenerlas libres de polvo y de exposición a la luz (Torres-Bugarín et al., 2015).
Análisis de muestras
El técnico responsable del análisis de las muestras desconocía la información relacionada con ellas, quien por muestra contabilizó 10,000 eritrocitos totales (ET), para identificar los valores de eritrocitos micronucleados (EMN), por medio de un microscopio equipado con fluorescencia (marca Zeiss ®) bajo el objetivo 100X. Se consideró como EMN cuando éste presenta en su citoplasma una estructura, pequeña, redonda u ovalada, bien definida de color amarillo brillante (tono característico del ADN por la tinción con naranja de acridina, que es específica para ácidos nucleicos), y que al enfocar y desenfocar el objetivo, éste se encuentre en el mismo plano de la célula; tal como se observa en la figura 1 (Torres-Bugarín et al., 2015).
Frotis de sangre periférica. Eritrocito normocromático micronucleado (EMN). Tinción naranja de acridina. Microscopio Binocular Carl Zeiss Mod. Axioscope A1 ® Fluorescencia IVFL Filtro de450 a 490 nanómetros, Cámara Axiocam MRc3 Rev1, Objetivo Planocromático 100x/1.25. Imagen capturada a 1,000 aumentos reales.
Análisis estadístico
Para la comparación de los valores de EMN se hicieron evaluaciones previas de índices de sesgo, curtosis y homoscedasticidad, para discriminar entre el uso de ANOVA o de Kruskal Wallis y proceder a su análisis. Se consideró como significativo el valor de P<0.05 y dado el caso, se practicaron pruebas de LSD, para la localización de grupos homogéneos. Se utilizó el programa STATGRAPHICS Centurion, ver. 15 (StatPoint, USA).
Consideraciones éticas
Todos los animales fueron tratados conforme a los procedimientos establecidos por la NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio (NOM-062-ZOO-1999; OCDE, 1999).
RESULTADOS
En la tabla 1, se puede observar el tamaño de muestra, los valores individuales y medias y errores estándar de valores basales de EMN. Se destaca que VR2 y VR1+VR2, presentaron frecuencia de EMN con efecto dosis respuesta (P=0.02, Kruskal Wallis).
Valores de eritrocitos micronucleados (EMN) en sangre periférica de becerras Holstein expuestas a las vacunas de prueba recombinante a través del tiempo
Toma de muestras
Valores de EMN/10,000 eritrocitos totales
CSS, (n=3)
CV, (n=2)
VR1, (n=3)
Vr2 (n=3)
VR1+VR2,(n=2)
Dia 1 Valores basales
2.6±1.98 (n=3)
Día 2
2, 2, 5
1, 2
1, 3, 4
1, 1, 3
1, 2
Día 3
1,1,3
1, 1
2, 2, 2
1, 1, 2
2, 2
Día 4
1, 3, 4
1, 2
0, 2, 3
1, 1, 2
2, 1
Día 90
1, 2, 3
1, 2
0, 2, 3
0, 1, 2
2, 2
Promedio general
2.4 ± 0.3
1.4 ± 0.2
2.5 ± 0.5
1.3 ± 0.2
2.0 ± 0.3
Se muestran valores individuales y promedio ± error estándar. EMN: eritrocitos micronucleados; CSS: control solución salina; CV: control vehículo; VR1: vacuna recombinante (PE-11); VR2: vacuna recombinante (PPE-68); VR1+VR2: vacuna recombinante (PE-11+PPE-68); n: tamaño de la muestra.
Al analizar los valores de EMN de todos los organismos en los diferentes grupos y días de muestreo, se identificó que los datos no cumplen con el principio de varianzas homogéneas y normalidad, por ello se aplicó la prueba Kruskal Wallis, con la que se encontró que los valores de EMN muestran aparente disminución a lo largo del tiempo, pero sin significancia estadística (P=0.70), (Figura 2).
Valores de eritrocitos micronucleados (EMN/10,000 eritrocitos) en sangre periférica de las becerras Holstein Freisan en los diferentes grupos de estudio y muestreadas en diferentes días. Los gráficos muestran media y error estándar.
En la tabla 1 y figura 3, se puede observar el efecto dosis respuesta (P=0.02, Kruskal Wallis) sobre las frecuencias de EMN de la aplicación de la VR2. Además, se debe destacar que los grupos CSS y VR1, así como los grupos CV y VR2 se comportan de manera muy similar (P>0.05); mientras que el grupo VR1+VR2 presenta valores de EMN intermedios entre VR1 y VR2 (P>0.05), ver figura 3.
Valores de eritrocitos micronucleados (EMN/10,000 ET) de sangre periférica de becerras Holstein Freisan tratadas. CSS: Solución salina, CV: Vector sin inserto (pVAX1), VR1: Vacuna recombinante codificada para PE11 (PE11/0.5 mg/mL de plásmido <italic>Micobacterium bovis</italic> (<italic>M. bovis</italic>), VR2: Vacuna recombinante codificada para PPE68 (PPE68/0.5 mg/mL de plásmido <italic>M. bovis</italic>, VR1+VR2 (PE11/0.25 mg/mL + PPE68/0.25 mg/mL). Los datos muestran media y errores estándar. CV, VR2 y VR1+VR2 <italic>vs</italic> CSS, (P=0. 02, Kruskal Wallis)*.
DISCUSIÓNLa raza vacuna Holstein Freisan como bioindicadora de genotoxicidad
Previo a evaluar la genotoxicidad de un agente mediante la prueba de MN en sangre periférica en un organismo que no esté probado como bioindicador de genotóxicos, se debe contar con los valores espontáneos de dicha especie (Zúñiga-González et al., 2001). En la situación específica del ganado vacuno, el valor espontáneo de EMN/10,000 eritrocitos descrito es de 2.4 ± 1.7 (promedio y error estándar) (Zúñiga et al., 1996); y los estudios experimentales de genotoxicidad son escasos. Sólo se localizó una investigación en la que describe el comportamiento de la raza Latvian Brown adultos, expuesta a radiaciones electromagnéticas, y se señala que los valores de EMN fueron de 0.6/1,000 vs 0.1/1,000 eritrocitos, en los animales no expuestos (Balode, 1996). Para el caso específico de la raza Holstein Friesian, no se tenían antecedentes, pero este grupo de trabajo encontró en animales Friesian de 9 meses de edad, valores espontáneos de EMN de 2.6 ± 1.98 /10,000 eritrocitos (promedio y error estándar); valor muy similar al descrito previamente por Zúñiga et al., (1996); sin embargo, en este último trabajo no se especificó sexo, raza o edad de los bovinos estudiados. Los valores encontrados de EMN en estos animales, supondría baja eficiencia, como bioindicador de genotóxicos, lo cual podría mejorar si se trabajara con becerras más jóvenes (Zúñiga et al., 2001). Estos resultados motivaron a evaluar los valores espontáneos de EMN y eritrocitos policromáticos (EPC) en terneras Holstein Freisan de 24-48 h de edad; de tal manera que se realizó la toma de muestras de sangre periférica a organismos recién nacidos de diferentes razas, como se observa en la tabla 2. Efectivamente, se corroboró que la edad de los animales determinan los valores de EMN y EPC, y así se pudo determinar que los animales más jóvenes presentan los valores más altos, y como se observa en la tabla 2, este patrón que se repite en terneros de las razas Simmental y Pardo Suizo (Villa, et al., 2015).
Eritrocitos policromáticos y micronucleados espontáneos en diferentes razas de becerros
Razas
n
Edad
EMN/10,000 ET
EPC/1000 ET
Referencia
13
9 m
1.6 ± 0.3
0
Este trabajo
Holstein Friesian
13
6 m
2.6 ± 0.5
0
Este trabajo
5
24-48 h
7.4 ± 1.0
7.4 ± 2.3
Villa, et al., 2015
Pardo Suizo
5
24-48 h
7.8 ± 0.7
9.0 ± 3.9
Villa, et al., 2015
Simmental
5
24-48 h
6.4 ± 0.7
11.8 ± 4.3
Villa, et al., 2015
n: tamaño de muestra; h: horas; m: meses; EPC: Eritrocitos policromáticos; EMN: micronucleados; promedio y error estándar.
Este fenómeno se ha observado en otras especies, ya que los valores espontáneos de EMN en sangre periférica de muchas especies, como la rata, ardilla y el humano, depende de la maduración del bazo, y éste madura con la edad (Zúñiga-González et al., 2001; Batista-González et al., 2006).
En el presente estudio se puede observar que la frecuencia de EMN tiende a disminuir con la edad (tabla 2), lo cual concuerda con lo ya descrito (Zúñiga-González et al; 2001). Por tal razón es que se recomienda el uso de animales jóvenes, y este trabajo es un antecedente en investigaciones con vacunos; en donde se puede observar claramente que la edad de los bovinos es un factor a considerar en los valores de EMN y de EPC.
Efecto genotóxico en la respuesta inmune de las vacunas recombinantes de prueba El objetivo del proyecto de Barba et al., (2013), fue proponer nuevas vacunas recombinantes para el control de la tuberculosis bovina. Después del diseño de las vacunas de prueba, se encontraron con la limitación de la disponibilidad de animales, por lo que se decidieron los tamaños de muestra reducidos, con el propósito de evaluar los grupos controles y experimentales necesarios. Por ello, en el presente trabajo exploratorio en el que se describe el efecto genotóxico, no fue posible ajustar el tamaño de muestra óptimo.
Al analizar el efecto genotóxico de las vacunas recombinantes antituberculosas, se identificó que los valores de EMN fueron menores con efecto dosis respuesta en los grupos tratados con VR2; esto puede interpretarse como un efecto citoprotector o antigenotóxico; sin embargo, se deben de tomar estos resultados con cautela, ya que hay dos puntos a considerar:
El primero de ellos fue el tamaño de muestra, que, aunque si bien la prueba de MN es altamente sensible y no se requiere de tamaños de muestra grande; lo ideal sería haber trabajado con más de cinco animales por grupo, pero por el costo, tamaño y
edad de estos animales, sólo se tuvo disponibilidad a dos o tres becerras por grupo; y esto pudo haber sesgando los resultados.
El segundo punto es que para determinar genotoxicidad mediante la prueba de micronúcleos en eritrocitos de sangre periférica, se debe considerar la actividad mitótica de la médula ósea, la cual se evalúa mediante la presencia o ausencia de EPC en sangre periférica. Los EPC son eritrocitos jóvenes que tienen como máximo 24 h de haber salido a circulación; esto debido a que la formación de MN se lleva a cabo durante la etapa de anafase -telofase de la división celular; y si ésta no ocurre, los MN no pueden formarse. Sin embargo, si hay división celular en médula ósea (mieloproliferación), se podrá observar sin dificultad alguna el efecto micronucleogénico o genotóxico de las substancias de prueba; en oposición; si éste último, inhibe la división celular (mielodepresión); esto es, si hay citotoxicidad, entonces no será posible observar el incremento de EMN en sangre periférica (efecto genotóxico).
Por tanto, volviendo a la figura 3, donde se observa que los valores de EMN en los grupos VR2 y VR1+VR2 es menor que en el grupo CSS (P=0.02); lo que en realidad pudo haber ocurrido, es que el uso de la VR2 está afectando de manera importante la medula ósea de las becerras, al punto de haber inducido mielodepresión por la actividad inmunológica generada. Sin embargo, en este estudio no se tiene manera de corroborar este efecto mediante la técnica clásica, por cuantificación de eritrocitos policromáticos en sangre periférica, ya que las becerras con edad promedio de 6 a 9 meses, no presentan este tipo de células (tabla 2).
Barba et al., (2013), paralelamente demostraron que la vacuna de ADN pVAX1-PPE68 (VR2) construida y evaluada en bovinos Holstein Freisan, indujo la producción de citocinas IFN-γ (proteínas producidas por los inmunocitos; en respuesta a un antígeno, generalmente viral) en animales vacunados por encima de los niveles de fondo, pero fue capaz de inducir la producción de anticuerpos dirigidos contra proteínas que reaccionan de forma cruzada en extractos celulares completos de M. bovis BCG; a diferencia de la vacuna recombinante pVAX1-PE11 (VR1), la cual no indujo respuesta inmune mediada por IFN-γ, al menos a niveles detectables por el kit comercial utilizado (Barba et al., 2013). Entonces, dicho de otra manera, sólo la vacuna VR2 produjo respuesta inmune y además modificación en la frecuencia de células micronucleadas (solo la vacuna VR2 tuvo efecto sobre este biomarcador); incluso cuando la dosis administrada fue por la mitad, la respuesta fue 50 %, menos en relación al grupo tratado con solución salina (CSS), como se observa en la figura 3. Lo que indica que la VR2, produce efecto sobre médula ósea, a tal grado que repercute en la formación de EMN. De esto se desprende que lo más probable es que la actividad inmunológica inducida por la vacuna VR2, también causa mielodepresión.
Este estudio, si bien preliminar; además de haber mostrado efecto dosis respuesta de las vacunas recombinantes antituberculosa, también abre una gran interrogante, ¿las vacunas recombinantes antituberculosas pueden tener como efecto secundario la mielodepresión? Es de destacar que la versatilidad de la prueba de micronúcleos en eritrocitos de sangre periférica, también permite evaluar el efecto mielodepresivo de vacunas recombinantes.
CONCLUSIONES
En este trabajo, aunque preliminar, arrojó resultados muy valiosos, se detectó efecto dosis respuesta de VR2 en la formación EMN; sin embargo, los resultados podrían estar enmascarados por posible mielodepresión (citotoxicidad), efecto que no se corroboró, debido a que los bovinos a esta edad promedio de 9 meses ya no presentan eritrocitos policromáticos en sangre periférica; se sugiere trabajar con bovinos de menos de un mes de nacidos y mayor número de animales. Estos hallazgos motivan a continuar investigando sobre la inducción de la inestabilidad genómica y citotoxicidad de las vacunas en general, y en particular las antiberculosas, ya que se desconoce su rol en medula ósea y en la integridad del material genético, tanto en organismos experimentales como de granja.
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The BCG (Bacillus Calmette-Guérin) vaccine for the control of bovine tuberculosis has variable efficacy and the generation and testing of new vaccines is required. For this reason, an exploratory study was carried out to evaluate the genotoxicity of two potential vaccines, recombinant bovine tuberculosis in Holstein Freisan calves with an average age of 9 months, using micronucleated erythrocytes (MNE). Five groups were formed: 1) Saline solution, 2) The vector pVAX1 (Vector without insert), CV), 3) Vaccine Mycobacterium bovis (M. bovis) type 1 (PE11 [VR1]), 4) Vaccine M. bovis type 2 (PPE68 [VR2]), 5) Both vaccines (VR1 + VR2). Five blood samples were taken from each organism: the first one prior to treatment, the second to the fourth sample every 24 hours and the fifth one 90 days after treatment. The samples were analyzed with microscopy and MNE/10,000 erythrocytes were counted. MNE frequencies decreased with age (Kruskall Wallis, 95%). When analyzing the treatments with respect to the control, a lower value of MNE was identified in the VR2 groups and in VR1 + VR2 (P = 0.02). These results appear to have a cytoprotective effect; however, it could be a masked myelosuppressive (cytotoxic) effect, since the frequency of MNE decreases due to myelosuppression. To confirm cytotoxicity, it is to continue the study in younger organisms suggested.
Keywords:Genotoxicitymicronucleicattle and recombinant antituberculous vaccineINTRODUCTION
The World Health Organization indicates that bovine tuberculosis is a chronic, zoonotic bacterial infectious-infectious disease of high morbidity and mortality and is endemic to developing countries; specifically in Mexico, it is prevalent throughout the country (OIE, 2020; PRONABIVE, 2015), where natural transmission in livestock is likely to be favored (Van der Heijden et al., 2017). The disease produces great economic losses due to the decrease in the population of cattle and milk; therefore, it requires constant control and prevention (Flores, 2012; Gooding y Brook, 2014; Ortíz, 2015; OIE, 2020). Mycobacterium bovis (M. bovis) and M. tuberculosis are the cause of tuberculosis. This disease forms nodules or tubers in the lymph nodes and various tissues, from where its name arises (Carriosa et al., 2015; Martínez et al., 2019).
The clinical signs can be subacute or chronic; the progressive rate is variable, in some animals the bacteria remain dormant or take years to manifest; while in others they can be seriously affected in a short time, and that is why it must be notified according to the Terrestrial Animal Health Code (OIE, 2020). It is by contact transmitted with infected individuals or tissues, by ingestion of contaminated food or body fluids (OIE, 2020; Herrera et al., 2008; Higareda-de Sales et al., 2015; Himsworth et al., 2010; Grange, 2001).
A proposal to eradicate the disease is vaccination, whose objective is to improve the immune response against tuberculosis, reduce the incidence of active disease; in addition to more durable protection, greater efficacy and safety, applicability to any population and compatibility with the rest of the vaccination schedule; as well as low cost (Barba et al., 2013).
For its part, the micronucleus (MN) test detects the loss of fragments or complete chromosomes during mitosis, and in peripheral blood. It is an excellent inexpensive, highly sensitive and informative tool does not require large sample sizes to assess possible damage to the DNA. Furthermore, in vivo models have the characteristic of transforming substances where it has been described that many of their metabolites can become more toxic than the original compound; as well as the immune response can be evaluated through activation of the bone marrow or myelosuppression (Cristaldi, 2004; Cedano etal., 2012; Torres-Bugarín et al., 2015; Castañeda et al., 2016).
For more than 100 years, the BCG vaccine (Calmette-Guérin bacillus), derived from an attenuated strain of M. bovis, has been used; called the Calmette-Guérin bacillus, for the prevention of bovine tuberculosis; this vaccine has variable efficacy (Cordero et al., 2013). Therefore, it is a priority to work on the generation of new vaccines, based on new knowledge about the genome of M. tuberculosis and M. bovis, together with their immune response (Cordero et al., 2013; Van der Heijden et al., 2017).
New strategies in the generation of vaccines, such as those of the DNA type, are tools that can be, for the prevention of bovine tuberculosis evaluated and exploited. In this regard, bovines vaccinated with a recombinant DNA variant (rDNA), which codes for the 85B, MPT64, and MPT83 antigens, have been to improve the immune response and decrease antigen loading, reported. Therefore, Barba, et al., (2013) evaluated the effectiveness of rDNA vaccines using other types of M. bovis antigens; for this, they cloned the genes that encode the proteins PE11 and PPE68, in the eukaryotic expression vector pVAX1. To do this they constructed the DNA vaccine, based on a eukaryotic expression vector (pVAX1, Invitrogen, USA), from which they produced PE11 and PPE68 proteins encoded in a gene present in RD1, a region absent from M. bovis BCG, a strain commonly used as a vaccine in humans and in experimental bovine models.
This strain contributes to cross reactivity and confusion between vaccinated and infected animals, when tested. They used pVAX1-PPE68 and PE11 to vaccinate Holstein Cattle, and to determine their ability to induce IFN-g production in vitro, as well as to generate antibodies in vaccinated animals.
RD1 is a 9.5 kb section of DNA called deletion region 1, it is present in virulent M. tuberculosis strains, but is removed in all attenuated strains of the M. bovis BCG vaccine. This region encodes at least nine genes. Some or all of the RD1 gene products may be involved in virulence and pathogenesis (Daugelat, et al., 2003).
Although the construction of new vaccines is necessary, it is also essential that these new treatments go through an evaluation process, both of their therapeutic efficacy, as well as possible toxic or genotoxic effects, in the short or long term.
Therefore, the objective of the present study was to evaluate the genotoxicity of recombinant tuberculosis vaccines developed by Barba, et al., (2013) in Holstein Friesian calves (Bos taurus).
MATERIAL AND METHODSType of study
Experimental, observational, longitudinal, comparative. With registration number CINV.020/15 before the Research Coordination of the University Center for Biological and Agricultural Sciences of the University of Guadalajara, Jalisco, Mexico.
Organisms
We worked with 13 healthy Holstein Friesian (Bos taurus) calves, with an average age of 9 months, from the Production Cofradía ranch, University of Guadalajara, Jalisco, Mexico. In biomedical research, working with animals of rare use represents difficulties, such as the ideal size and number of animals, as well as maintenance and care. As the OECD points out, bovines are a kind of rare use in biomedical research; due to ethics, methodology and high cost, the principle of using the minimum number of animals must be respected. In the particular case where the study was carried out, it was not possible to use the ideal number of calves, due to the logistics of care, accommodation and feeding (OCDE, 1999).
Groups of study
Five groups were formed, to which a 1.0 mL dose was administered intramuscularly, of one of the following compounds:
Group 1) [n=3] Control Sterile saline solution at 0.9% (p/v) (CSS). Group 2) [n=2] Vector Control without insert pVAX1 (CV).
Group 3) [n=3] Recombinant vaccine encoded for PE11: 0.5 mg/mL plasmid M. bovis (VR1).
Group 4) [n=3] Recombinant vaccine encoded for PPE68: 0.5 mg/mL plasmid M. bovis (VR2).
This vector was designed according to FDA guidelines; eukaryotic DNA sequences are limited to those required for expression in order to minimize the possibility of chromosomal integration (Barba et al., 2013).
Preparation of PE11 and PPE68 vaccines
These were prepared at the Jalisco State Center for Research and Assistance in Technology and Design (CIATEJ), where the coding regions of the PE11 and PPE68 genes were amplified from genomic DNA from M. bovis; by polymerase chain reaction with oligonucleotides, specific and expressly designed for this project. The identity and fidelity of the amplified sequence was verified by restriction with type II endonucleases (XbaI and HindIII) and sequencing. These were then inserted into the eukaryotic expression vector pVAX1. Plasmid DNA was purified using a commercial Quiagen Plasmid Plus Midi kit (Barba et al., 2013).
PE11 and PPE68 proteins
These families of globular structure proteins are those that confer the greatest variability to M. tuberculosis. The PE11 protein (Proline-Glutamic Acid motifs at the level of the N- terminus), are characterized by being rich in proline and glutamic acid, and the PPE68 protein (proline, proline, glutamic acid) is defined by tandem repeats (MPTRs) (Fontalvo Rivera y Gómez Camargo, 2015).
Generation of recombinant vaccines
Recombinant plasmids transformed into Escherichia coli DH5α, and containing the PE11 or PPE68 proteins, were obtained by means of the commercial Quiagen Plasmid Plus Maxi kit, and mixed with isotonic saline solution (SSI); until adjusted to a volume of 0.5 mL, with a concentration of 500 µg/mL (administered vaccine). The PE11 and PPE68 genes were amplified by PCR with the help of the high-fidelity Phusion enzyme (Finnizymes, USA) and the M. bovis AN5 genomic DNA as template, and the primer pair MbPPE68-5FH3 (5´-GGAGAAGCTTGTCACCATGCTGTGG- 3)+MbPPE683RXb3RXb(5´-GATCCGCTCTAGATTACCTGCCTCCTG-3').
The PCR products were digested with HindIII and XbaI (New England Biolabs, USA), and then ligated with the pVAX1 vector, using the same restriction sites. Cloning was confirmed by restriction digestion, and the ratio between identity and fidelity of the inserted gene. Then verified by sequencing performed at the Genomics Laboratory for Biodiversity (LANGEBIO, Cinvestav Irapuato, Mexico). The expression of cloned genes in pVAX1 depends on its CMV promoter, as well as on the Kozak and ATG sequences that are incorporated into the primers given its absence in pVAX1; as pointed out by Barba and his collaborators (Barba et al., 2013).
Sample collection and processing
Peripheral blood samples were taken from each calf, the first one prior to treatment; from the 2nd to the 4th every 24 hours, and the last after 90 days. Needle puncture number 18 took the sample from the jugular, and two smears were made per sample, which were left to dry in the open air and fixed in 96% ethanol for 10 minutes. The second smear was for backup purposes. Subsequently, they were stained with acridine orange, specific staining for nucleic acids (Hayashi, 1990) and they were kept until their analysis in boxes to keep them free of dust and exposure to light (Torres-Bugarín et al., 2015).
Sample analysis
The technician responsible for the analysis of the samples was unaware of the information related to them, who per sample counted 10,000 total erythrocytes (ET), to identify the values of micronucleated erythrocytes (MNE), through a microscope equipped with fluorescence (Zeiss® brand) under 100X objective. It was considered as MNE when it presents in its cytoplasm a small, round or oval structure, well defined with a bright yellow color (characteristic tone of DNA due to acridine orange staining, which is specific for nucleic acids). When focusing and blur the objective, it is in the same plane of the cell as seen in figure 1 (Torres-Bugarín et al., 2015).
Peripheral blood smear. Micronucleated normochromatic erythrocyte (MNE). Acridine orange stain. Carl Zeiss Binocular Microscope Mod. Axioscope A1® IVFL Fluorescence Filter 450 to 490 nanometers, Axiocam MRc3 Rev1 Camera, 100x/1.25 Planochromatic Objective. Image captured at 1,000 actual magnifications.
Statistical analysis
For the comparison of the MNE values, previous evaluations of bias, kurtosis and homoscedasticity indices were made, to discriminate between the use of ANOVA or Kruskal Wallis and proceed to their analysis. The value of P <0.05 was considered significant and, if appropriate, LSD tests were performed to locate homogeneous groups. The program STATGRAPHICSä Centurion, ver. 15 (StatPoint, USA).
Ethical considerations
All animals were treated in accordance with the procedures established by the Official Mexican STANDARD NOM-062-ZOO-1999, technical specifications for the production, care and use of laboratory animals (NOM-062-ZOO-1999; OCDE, 1999).
RESULTS
Table 1 shows the sample size, the individual and mean values, and the standard errors of the baseline values of the MNE. It should be noted that VR2 and VR1+VR2, presented a frequency of MNE s with a dose response effect (P=0.02, Kruskal Wallis).
Values of micronucleated erythrocytes (MNEs) in peripheral blood of Holstein calves exposed to recombinant test vaccines over time
Sampling
Values of MNE /10,000 erythrocytes totals
CSS, (n=3)
CV, (n=2)
VR1,(n=3)
VR2, (n=3)
VR1+VR2, (n=2)
Day 1
2.6 ± 1.98 [n=13]
Basal Values
Day 2
2, 2, 5
1, 2
1, 3, 4
1, 1, 3
1, 2
Day 3
1,1,3
1, 1
2, 2, 2
1, 1, 2
2, 2
Day 4
1, 3, 4
1, 2
0, 2, 3
1, 1, 2
2, 1
Day 90
1, 2, 3
1, 2
0, 2, 3
0, 1, 2
2, 2
General Average
2.4 ± 0.3
1.4 ± 0.2
2.5 ± 0.5
1.3 ± 0.2
2.0 ± 0.3
Individual values and average ± standard error are shown. MNE: micronucleated erythrocytes; CSS: control saline solution; CV: vehicle control; VR1: recombinant vaccine (PE-11); VR2: recombinant vaccine (PPE-68); VR1+VR2: recombinant vaccine (PE-11+PPE-68); n: sample size.
When analyzing the MNE values of all the organisms in the different groups and sampling days, it was identified that the data do not comply with the principle of homogeneous variances and normality. Therefore the Kruskal Wallis test was applied, with which it was found that MNE values show apparent decrease over time, but without statistical significance (P=0.70), (Figure 2).
Values of micronucleated erythrocytes (MNE/10,000 erythrocytes) in peripheral blood of Holstein Freisan calves in the different study groups and sampled on different days. The charts show mean and standard error
In table 1 and figure 3, the dose response effect (P=0.02, Kruskal Wallis) on the MNE frequencies of the VR2 application can be observed. Furthermore, it should be noted that CSS and VR1 groups, as well as CV and VR2 groups behave in a very similar way (P>0.05); while the VR1+VR2 group presents intermediate MNE values between VR1 and VR2 (P> 0.05), see figure 3.
Values of peripheral blood micronucleated red cells (MNE/10,000 ET) from treated Holstein Freisan calves. CSS: Saline solution, CV: Vector without insert (pVAX1), VR1: Recombinant vaccine encoded for PE11 (PE11/0.5 mg/mL plasmid <italic>Micobacterium bovis</italic> (<italic>M. bovis</italic>), VR2: Recombinant vaccine encoded for PPE68 (PPE68/0.5 mg/mL of plasmid <italic>M. bovis</italic>, VR1+VR2 (PE11/0.25 mg/mL+PPE68/0.25 mg/mL). Data shows mean and standard errors. CV, VR2 and VR1+VR2 vs CSS, (P=0.02, Kruskal Wallis)*.
DISCUSSIONThe Holstein Freisan vaccine breed as a bioindicator of genotoxicity
Before evaluating the genotoxicity of an agent by means of the MN test in peripheral blood in an organism that has not been as a bioindicator of genotoxic agents, tested, the spontaneous values of this species must be available (Zúñiga-González et al., 2001). In the specific situation of cattle, the spontaneous MNE/10,000 erythrocyte value described is 2.4±1.7 (mean and standard error) (Zúñiga et al., 1996); and experimental studies of genotoxic are scarce. Only one investigation was found that describes the behavior of the adult Latvian Brown breed, exposed to electromagnetic radiation, and it is noted that the MNE values were 0.6/1,000 vs. 0.1/1,000 erythrocytes, in unexposed animals (Balode, 1996). For the specific case of the Holstein Freisan breed, there was no history, but this working group found spontaneous MNE values of 2.6±1.98/10,000 erythrocytes (mean and standard error) in 9-month-old Friesian animals. Value very similar to that previously described by Zúñiga et al., (1996); however, in this last study, the sex, breed or age of the cattle studied was not specified. The MNE values found in these animals would suppose low efficiency, as a bioindicator of genotoxic agents, which could improve if working with younger calves (Zúñiga et al., 2001). These results motivated the evaluation of the spontaneous values of MNE and polychromatic erythrocytes (EPC) in Holstein Freisan calves 24-48 h old; in such a way that the peripheral blood samples were taken from newborn organisms of different breeds, as observed in Table 2. Indeed, it was confirmed that the age of the animals determine the values of MNE and EPC, and it was possible to determine that the youngest animals present the highest values, and as observed in Table 2, this pattern is repeated in calves of the Simmental and Brown Swiss breeds (Villa, et al., 2015).
This phenomenon has been observed in other species, since the spontaneous values of MNE in peripheral blood of many species, such as the rat, squirrel and the human, depend on the maturation of the spleen, and the spleen matures with age (Zúñiga-González et al., 2001; Batista-González et al., 2006).
In the present study, it can be seen that the frequency of MNE tends to decrease with age (Table 2), which agrees with what has already been described (Zúñiga-González et al; 2001). For this reason, the use of young animals is recommended, and this work is an antecedent in research with cattle; where it can be clearly seen that the age of the bovines is a factor to consider in the MNE and EPC values.
Polychromatic erythrocytes and spontaneous micronucleates in different breeds of calves
Races
n
Age
MNE /10,000 ET
EPC/1000 ET
Reference
13
9 m
1.6 ± 0.3
0
This paper
Holstein Friesian
13
6 m
2.6 ± 0.5
0
This paper
5
24-48 h
7.4 ± 1.0
7.4 ± 2.3
Villa, et al., 2015
Swiss Brown
5
24-48 h
7.8 ± 0.7
9.0 ± 3.9
Villa, et al., 2015
Simmental
5
24-48 h
6.4 ± 0.7
11.8 ± 4.3
Villa, et al., 2015
n: size of sample; h: hours; m: months; EPC: Polychromatic Erythrocytes; MNE: micronucleate; average and standard error.
Genotoxic effect on the immune response of recombinant test vaccines
The objective of the Barba et al., (2013), project was to propose new recombinant vaccines for the control of bovine tuberculosis. After the design of the test vaccines, they were limited by the availability of animals, so the reduced sample sizes were decided, in order to evaluate the necessary control and experimental groups. Therefore, in the present exploratory study describing the genotoxic effect, it was not possible to adjust the optimal sample size.
When analyzing the genotoxic effect of the recombinant tuberculosis vaccines, it was identified that the MNE values were lower with a dose-response effect in the groups treated with VR2; this can be interpreted as a cytoprotective or antigenotoxic effect; however, these results should be taken with caution, since there are two points to consider:
The first of these was the sample size, which, although the MN test is highly sensitive and does not require large sample sizes. The ideal would have been to work with more than five animals per group, but due to the cost, size and age of these animals, only two or three calves per group were available; and this may have skewed the results.
The second point is that to determine genotoxicity by means of the micronucleus test in peripheral blood erythrocytes, the mitotic activity of the bone marrow must be considered, which is evaluated by the presence or absence of EPC in peripheral blood. The EPCs are young red blood cells that have a maximum of 24 hours of being released; this because the formation of MN is carried out during the anaphase-telophase stage of cell division; and if this does not occur, the MNs cannot form. However, if there is cell division in the bone marrow (myeloproliferation), the micronucleogenic or genotoxic effect of the test substances can be easily observed; in opposition; if the latter inhibits cell division (myelosuppression); that is, if there is cytotoxicity, then it will not be possible to observe the increase in MNE in peripheral blood (genotoxic effect).
Therefore, going back to figure 3, where it is observed that the values of MNE in the VR2 and VR1+VR2 groups is lower than in the CSS group (P=0.02). What may have actually happened is that the use of VR2 is significantly affecting the calf's bone marrow, to the point of having induced myelosuppression due to the generated immune activity. However, in this study there is no way to corroborate this effect using the classical technique, by quantifying polychromatic red blood cells in peripheral blood, since calves with an average age of 6 to 9 months do not present this type of cells (Table 2 ).
Barba et al., (2013), in parallel demonstrated that the DNA vaccine pVAX1-PPE68 (VR2) constructed and evaluated in Holstein Freisan cattle, induced the production of IFN-γ cytokines (proteins produced by immunocytes; in response to an antigen, generally viral) in animals vaccinated above background levels. In addition, it was able to induce the production of antibodies directed against proteins that cross-react in complete cell extracts of M. bovis BCG; unlike the recombinant vaccine pVAX1-PE11 (VR1), which did not induce an IFN-γ-mediated immune response, at least at levels detectable by the commercial kit used Barba et al., (2013). In other words, then, only the VR2 vaccine produced an immune response and also a change in the frequency of micronucleated cells (only the VR2 vaccine had an effect on this biomarker); even when the administered dose was half, the response was 50%, less in relation to the group treated with saline solution (CSS), as observed in figure 3. This indicates that VR2 produces an effect on bone marrow, to such an extent that it affects the formation of MNEs. From this, it follows that the most likely immunological activity induced by the VR2 vaccine also causes myelosuppression.
This study, although preliminary, in addition to having shown a dose-response effect of recombinant tuberculosis vaccines, it also raises a big question, can recombinant tuberculosis vaccines have myelosuppression as a side effect? It is noteworthy that the versatility of the micronucleus test in peripheral blood erythrocytes also allows evaluating the myelosuppressive effect of recombinant vaccines.
CONCLUSIONS
In this work, although preliminary, it yielded very valuable results; a dose response effect of VR2 was in the MNE formation, detected. However, the results could be masked by possible myelosuppression (cytotoxicity), an effect that was not corroborated, since bovines at this average age of 9 months do not present polychromatic erythrocytes in peripheral blood; it is suggested to work with bovines less than one month old and a larger number of animals. These findings motivate us to continue investigating the induction of genomic instability and cytotoxicity of vaccines in general, and in particular anti- tuberculosis drugs, since their role in bone marrow and in the integrity of genetic material is unknown, both in experimental organisms and in farm.