La congelación de semen puede causar daños en la estructura de los espermatozoides, o cambios en la distribución de enzimas en las membranas; disminuyendo su capacidad fecundante (Hernández et al., 2017). Para conocer esto, se han creado diversas pruebas en el laboratorio que están basadas exclusivamente en la evaluación de la estructura celular, permitiendo valorar adecuadamente una muestra seminal y así poder predecir la fertilidad del macho (Díaz et al., 2009; Puente et al., 2016). Las pruebas ideales son aquellas que de forma sencilla y eficaz permiten realizar pruebas diagnósticas para evaluar la capacidad fecundante de un eyaculado (Osorio et al., 2007).

El acrosoma es una estructura ubicada en la parte apical de la cabeza espermática, juega un papel fundamental en la fecundación, ya que los daños en la misma generan la liberación de enzimas de su interior, perdiendo la capacidad de fecundación de los espermatozoides (Osorio et al., 2007; Atuesta et al., 2012; Ugarelli et al., 2017); por lo que es importante valorar la integridad acrosomal de los espermatozoides. El acrosoma es una vesícula secretoria del espermatozoide que contiene diferentes enzimas, especialmente acrosina, responsables de la digestión del cumulus oophorus y de la zona pelúcida.

La morfología normal del acrosoma tiene un borde apical normal (NAR, normal apical ridge), La determinación de NAR es uno de los parámetros espermáticos de mayor importancia, debido a su papel en la reacción acrosomal para la fecundación del ovocito: observándose una relación entre el NAR y la tasa de fecundación, por lo que conviene realizar pruebas específicas para la valoración de NAR, como una forma de predicción de fertilidad (Bonet et al., 2006; Nieto, 2010; Puente et al., 2016).

Existen diversas técnicas que permiten realizar la valoración de NAR, entre las que destacan los métodos fluorescentes; donde se conjugan diversas sustancias de alto costo y complicadas de conseguir con equipo especializado, haciendo a estas técnicas poco comunes de realizar (Montesinos et al., 2014; Restrepo et al., 2016). Debido a esto, se han diseñado otras pruebas utilizadas habitualmente en los laboratorios, como práctica de rutina y que son más accesibles, en donde sólo se requiere un microscopio de contraste de fases; entre las que se pueden mencionar: Eosina-Nigrosina, Eosina-Verde rápido, Tinción triple, Tinción Spermac y Tinción de Giemsa; posiblemente siendo esta última la técnica de tinción más utilizada (Bonet et al., 2006; Bernardi et al., 2011; Restrepo et al., 2013). Debido a lo anterior, es importante diseñar técnicas eficientes, prácticas y fáciles de realizar para valorar NAR de los espermatozoides.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la técnica modificada de tinción de Giemsa, para la valoración de NAR en espermatozoides de mamíferos.

Ubicación. El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Análisis Clínicos y Laboratorio de Histopatología Veterinaria de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, durante los meses de agosto a septiembre de 2018.

Población y muestra. Se valoró NAR de 140 laminillas de espermatozoides de 4 diferentes especies de mamíferos: bovinos (20), ovinos (40), porcinos (50) y humanos (30). En bovinos y ovinos, las muestras fueron obtenidas de semen descongelado, para las muestras de porcinos fue de semen diluido en diluyente comercial MRA®, se usó dos días después de su extracción; y para el semen de humanos, éstas fueron de semen fresco.

Metodologías de la tinción. Las laminillas se dividieron en dos grupos, con 70 laminillas cada uno; el primer grupo, fue teñido con la metodología clásica de tinción Giemsa, para valorar NAR, propuesta por Whatson y Martín (1972).

El segundo grupo, fue teñido con la técnica de tinción Giemsa modificada; donde el procedimiento fue el siguiente: una vez seco el frotis de espermatozoides, el proceso de fijación se llevó a cabo mediante la adición de alcohol etílico de 96°, el cual se adicionó con una inclinación en la laminilla de 35° a chorro lento y continuó durante cinco segundos (figura 1), y se dejó secar en una platina a 36 °C, hasta que el alcohol se deshidrató por completo. Posteriormente se agregó la tinción de Giemsa (Sigma-Aldrich), previamente preparado con 0.6 g de Giemsa, en 20 ml de agua destilada, y se mantuvo durante 25 minutos; enseguida se lavó con agua destilada, a chorro lento y siguió con una inclinación de la laminilla de 35°, procurando que el chorro no tocara la porción donde se encontraba el frotis de espermatozoides (figura 1), dejándose secar en una platina durante dos minutos a 36 °C. La evaluación de NAR se realizó al microscopio óptico en el objetivo de 1000X con aceite de inmersión. El criterio de evaluación del acrosoma fue en clasificar como NAR, aquellos espermatozoides en los cuales el capuchón estaba suavemente adherido al núcleo y poseían un borde apical que formaba una creciente suave.

Figura 1

Evaluación y análisis estadístico. Para ambos grupos, se contaron 200 espermatozoides por laminilla, y se obtuvo el porcentaje de acrosomas NAR, observando si existían diferencias en la nitidez (mejor calidad de la imagen en la membrana acrosomal y borde apical del acrosoma) de las estructuras acrosomales y el tiempo de realización de la técnica en ambos grupos. Se realizó un análisis descriptivo de cada una de las especies en estudio; además de una prueba t-student para el contraste de medias (p<0.05). Se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 20.0 (IBM, 2011).

En la figura 1 se muestra la fijación del frotis, y en la figura 2 se muestran las fotografías de acrosomas NAR con espermatozoides de bovinos, porcinos, humanos y ovinos, observado con microscopio óptico a 1000X. En las imágenes se observa que en la técnica de tinción Giemsa modificada, la imagen se aprecia más nítida, con membranas acrosomales y bordes apicales acrosomales mejor teñidos; también la cabeza, cuerpo y cola espermática se observan con una mejor definición.

Figura 2 1-A espermatozoides de bovinos teñidos con técnica de tinción Giemsa clásica y 1-B espermatozoides de bovinos teñidos con la tinción Giemsa modificada. 2-A espermatozoides de humanos teñidos con técnica de tinción Giemsa clásica y 2-B espermatozoides de humanos teñidos con la tinción Giemsa modificada. 3-A espermatozoides de ovinos teñidos con técnica de tinción Giemsa clásica y 3-B espermatozoides de ovinos teñidos con la tinción Giemsa modificada. 4-A espermatozoides de porcinos teñidos con técnica de tinción Giemsa clásica y 4-B espermatozoides de porcinos teñidos con la tinción Giemsa modificada.

Tabla 1

	Tratamientos	N	Media	Desviación estándar	Media de error estándar
Bovino	Original	10	83.200	7.4803	2.3655
	Modificado	10	84.600	7.4416	2.3532
Porcino	Original	25	89.320	2.6255	.5251
	Modificado	25	90.800	2.2361	.4472
Humano	Original	15	90.333	3.2440	.8376
	Modificado	15	90.133	3.4614	.8937
Ovino	Original	20	94.550	2.5021	.5595
	Modificado	20	94.850	2.4554	.5490

No se encontró diferencia en los porcentajes de las medias (p˃0.05).

No hubo diferencia entre las medias de acrosomas NAR en ambas técnicas de tinción; sin embargo, mientras la técnica convencional tarda 115 minutos, el tiempo de realización de la técnica modificada fue de 35 minutos; reduciendo el tiempo 80 minutos, con una mejor claridad de la imagen.

En cuanto a acrosomas NAR, no hubo diferencia del porcentaje de las medias entre ambos grupos, lo cual significa que se puede utilizar la técnica de tinción Giemsa modificada, obteniendo buena valoración de acrosomas NAR; por otro lado, también se puede observar que la técnica tinción Giemsa modificada, reduce en 80 minutos el tiempo de tinción de acrosomas NAR, al no colocarse durante 90 minutos en la tinción Giemsa y 15 minutos en el formaldehído al 5 %, como en la técnica original. Se puede decir que la técnica de tinción Giemsa modificada, es eficiente, rápida y sencilla de realizar; cumpliendo las características que indicaron Osorio et al. (2007) de las técnicas de laboratorio para evaluación del semen.

La modificación de la técnica de tinción Giemsa, no es afectada por los diluyentes de congelación, lo cual puede ser observado en la figura 2, en 1-B y 3-B; en las cuales se utilizó semen de bovino y ovino descongelado, obteniendo mejor nitidez de la imagen del acrosoma con la técnica de tinción Giemsa modificada; así como lo indica Muiño et al. (2005), el cual menciona que la mayoría de las tinciones empleadas para microscopía óptica, no son adecuadas para la evaluación de semen; ya que requieren el uso de fijadores, como formaldehído o glutaraldehído, que suelen interferir con los diluyentes utilizados para la congelación, dificultando de manera importante el análisis.

En la figura 2, en 1-B, 2-B, 3-B y 4-B se puede observar que al utilizar la técnica de tinción de Giemsa modificada, se tiene una mejor nitidez de la imagen de acrosomas NAR, a comparación de los espermatozoides teñidos con la técnica original como se observa en la figura 2 en 1-A, 2-A, 3-A y 4-A; por lo que el alcohol de 96° utilizado, cumple un papel sumamente importante al permitir la fijación de espermatozoides en el frotis para su tinción; esto puede ser debido al uso del alcohol de 96° como fijador del frotis, como lo menciona González et al., (2015) y Gorodner, (2013), los cuales mostraron que el alcohol de 96° es un buen fijador que conserva sin alterar componentes celulares, pero con escasa penetración, por lo que se utiliza para fijar extendidos citológicos.

El alcohol de 96° es utilizado en aspersión durante pocos segundos y el frotis se deja secar al aire, permitiendo fijar la muestra obtenida y posteriormente colocar la tinción (López y Casasbuenas, 2015); coincidiendo con Juárez et al., (2008), que menciona el uso del alcohol de 70° en conjunto con alcohol de 96° y su combinación con otros reactivos (xilol, formaldehído, etc.) para la evaluación de la morfología normal del espermatozoide; mientras que Fernández et al. (2001) y Sánchez et al., (2014) utilizaron el alcohol de 96° para fijar muestras de espermatozoides humanos y poder observar el grado de madurez nuclear y morfología espermática, obteniendo buenos resultados.

La técnica de tinción Giemsa modificada disminuye el tiempo de valoración de la integridad acrosomal y muestra mejor nitidez de la imagen del acrosoma al momento de la observación.