Entre los principales retos que enfrenta la industria avícola, destaca el control de Alphitobius diaperinus (A. diaperinus) (Crippen et al., 2018), ya que este escarabajo es reservorio de numerosos patógenos en aves y humanos (do Carmo et al., 2019). Además, aunque el hábitat principal de A. diaperinus, es el estiércol o la basura (Govorushko, 2019), sus larvas pueden trepar paredes (Santoro et al., 2008) y postes de soporte en instalaciones para aves (Rice y Lambkin, 2009). Causando daños en los materiales de aislamiento durante sus procesos de pupación (Hazeleger et al., 2008; Wales et al., 2010; Crippen et al., 2018). El control de este insecto, generalmente se realiza con insecticidas (Arena et al., 2019). Destacando el i) fenitrotión, ii) cyßuthrin y iii) spinosad (Tomberlin et al., 2014; Hickmann et al., 2018). Sin embargo, muchos de estos químicos no tienen efecto sobre la etapa adulta del escarabajo (do Prado et al., 2013).

Además, Lambkin et al. (2010) reportaron una mayor resistencia de A. diaperinus a fenitrotión, en 11 granjas avícolas de engorda. Especialmente al sureste de Queensland, donde numerosas aplicaciones de fenitrotión se han realizado de manera constante. Una alternativa de control para A. diaperinus es el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (B. bassiana) (Martins et al., 2016).

Este hongo es utilizado como insecticida biológico o biopesticida controlando un gran número de parásitos como orugas, termitas, moscas blancas, áfidos y escarabajos (Daniel et al., 2019), al causarles micosis o enfermedad blanca de la muscardina (Santoro et al., 2008; Mascarin y Jaronski, 2016). En México producto de una investigación precedente realizada por (Prado et al., 2014), se evaluó la patogenicidad de cinco cepas del hongo Beauveria bassiana en adultos de escarabajo Alphitobius diaperinus bajo condiciones de laboratorio obteniendo buenos resultados. Por lo que, a partir de ese estudio, surgió la necesidad de realizar investigaciones con nuevas cepas mexicanas del hongo Beauveria bassiana. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de diferentes cepas de B. bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes) contra A. diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae) de granjas avícolas en el estado de Colima.

Lugar experimental.

Los bioensayos se realizaron en el Laboratorio de Control Biológico de la DES: Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Colima. Las condiciones del Laboratorio fueron 25 ± 1 °C de temperatura, 80 ± 4 % de humedad relativa (HR), y 12:12 h luz/obscuridad (L/O).

Procedencia de A. diaperinus.

Un total de 360 escarabajos A. diaperinus (adultos) fueron colectados de granjas avícolas en el estado de Colima, durante la 7^a semana de producción (septiembre y octubre del 2016). La captura se llevó a cabo en diversos sitios de la cama de las aves, con el uso de pinzas entomológicas. Los A. diaperinus fueron transportados en frascos de 6 cm de diámetro x 7 cm de alto, al laboratorio para su identificación taxonómica de acuerdo a (Chernaki y Almeida, 2001; Dunford y Kaufman, 2006).

Origen de las cepas B. bassiana.

Se utilizaron cinco cepas de B. bassiana (Bb3, Bb4, Bb5, Bb6 y Bb17) de la colección de hongos entomopatógenos del Laboratorio de Control Biológico de la DES: Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Colima y del Laboratorio de Parasitología y Control Biológico del Departamento de Veterinaria y Zootecnia, División Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato.

Etapa experimental (Fase 1). Multiplicación, viabilidad y concentración de cepas de B. bassiana.

Las cinco cepas de B. bassiana fueron multiplicadas en medio sólido de agar dextrosa sabouraud (ADS) e incubadas por 21 d. Un día antes de realizar el bioensayo, los conidios se cosecharon con un asa bacteriológica y se colocaron en un frasco de vidrio de 2 x 8 cm con capacidad de 25 mL, que contenía 10 mL de agua destilada estéril con Tween 80 (00102; Sigma Chemical CO., Saint Louis, MO) al 0.01%. La mezcla se homogenizó (agitando) por 5 min y se determinó la viabilidad de los conidios de cada cepa mediante microcultivo (Santoro et al., 2008; Mascarin y Jaronski, 2016). Se consideró como cepa viable, aquella donde se observó más del 90% de los conidios germinados (Geden y Steinkraus, 2003; Daniel et al., 2019). Para determinar la concentración de los conidios se utilizó una cámara de Neubawer. Los cinco tratamientos de B. bassiana (Bb3, Bb4, Bb5, Bb6 y Bb17) presentaron una concentración de 1 x 10⁸ conidios/mL.

Experimento (Fase 2). Patogenicidad.

Rezende et al. (2009) y Alves et al. (2015) sugirieron emplear entre 10 y 20 escarabajos. Por lo tanto, se emplearon 15 escarabajos A. diaperinus (adultos) para el testigo y por cada cepa de B. bassiana (Bb3, Bb4, Bb5, Bb6 y Bb17), con cuatro réplicas/tratamiento. Cada A. diaperinus fue transferido a un vaso de precipitado estéril con capacidad de 250 mL, que contenía 10 mL de suspensión (1 x 10⁸ conidios/mL) de cada tratamiento y (únicamente agua destilada estéril con Tween 80 al 0.01%) para el testigo. Después de la inoculación, los A. diaperinus fueron colocados en cajas Petri, con papel filtro húmedo con agua destilada estéril. La mortalidad se registró cada 12 h después de la inoculación por un lapso de 10 d. Los escarabajos muertos se colocaron individualmente en cajas Petri con papel filtro húmedo con agua destilada estéril y se incubaron por 21 d, para promover el crecimiento del micelio y con ello determinar si la muerte fue causada por B. bassiana.

Análisis estadístico.

Para el tratamiento de los datos obtenidos se utilizó el programa estadístico (SAS, System, v. 9.0.2, Cary, NC). Para evaluar el diseño completamente al azar, el siguiente modelo fue probado:

γ ij = μi + ϵij

donde:

γ_𝑖𝑗 = observación de la j-ésimo u.e. de i-ésimo tratamiento;

μ_𝑖 = media del i-ésimo tratamiento; y

ε_𝑖𝑗 = error experimental de la unidad 𝑖𝑗.

El conjunto de datos resultante se analizó para estadística descriptiva por (PROC UNIVARIATE; SAS, 2010). La comparación entre tratamientos (testigo, Bb3, Bb4, Bb5, Bb6 y Bb17), se llevó a cabo por (PROC ANOVA; SAS, 2010). Cuando se encontró efecto significativo por grupo (P < 0.05), se realizó la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los datos obtenidos para micosis, se transformaron al arco seno x-/100 * Sin-1 , se expresaron en porcentaje y fueron graficados.

Los estadísticos descriptivos para el total de muertos y el total de muertos por micosis, ocasionada por las cinco cepas de B. bassiana sobre escarabajos A. diaperinus (adultos) de granjas avícolas en el estado de Colima. Se puede apreciar que las cepas probadas en el total de escarabajos muertos y el total de escarabajos muertos por micosis mostraron valores mayores que el testigo, donde la cepa Bb4 fue la que obtuvo los valores más altos, como se muestran en la tabla 1.

Tabla 1

	x ± DE a	ICb		P10-P90		P25-P75
Total de muertos
Testigo	1.00 ± 0.81		0.00 – 2.19		0.00 – 2.00	0.25 – 1.75
Cepas de B. bassiana
Bb3	1.50 ± 1.73		0.00 – 4.25		0.00 – 4.00	0.25 – 3.25
Bb4	5.25 ± 0.95		3.72 – 6.77		4.00 – 6.00	4.25 – 6.00
Bb5	2.50 ± 1.00		0.90 – 4.09		2.00 – 4.00	2.00 – 3.50
Bb6	2.00 ± 0.81		0.70 – 3.29		1.00 – 3.00	1.25 – 2.75
Bb17	2.00 ± 1.41		0.00 – 4.25		0.00 – 3.00	0.50 – 3.00
Total de muertos por micosis c
Testigo	0.00 ± 0.00		0.00 – 0.00		0.00 – 0.00	0.00 – 0.00
Cepas de B. bassiana
Bb3	0.50 ± 0.57		0.00 – 1.41		0.00 – 1.00	0.00 – 1.00
Bb4	2.50 ± 1.29		0.44 – 4.55		1.00 – 4.00	1.25 – 3.75
Bb5	1.00 ± 1.15		0.00 – 2.83		0.00 – 2.00	0.00 – 2.00
Bb6	0.25 ± 0.50		0.00 – 1.04		0.00 – 1.00	0.00 – 0.75
Bb17	0.75 ± 0.95		0.00 – 2.27		0.00 – 2.00	0.00 – 1.75

^a

Media ± desviación estándar; ^bintervalo de confianza al 95%; ^cconfirmación por crecimiento de micelio de B. bassiana.

La cepa Bb4 de B. bassiana presentó diferencia entre grupos, con respecto a la mortalidad (5.25 ± 0.95 escarabajos A. diaperinus muertos). La mortalidad más baja entre cepas de B. bassiana se cuantificó en Bb3 (tabla 2). En los escarabajos muertos, la micosis por crecimiento del micelio de B. bassiana, presentó los mejores resultados en la cepa Bb4 (2.50 ± 1.29 escarabajos A. diaperinus con micosis) equivalente al 16.66% (figura 1).

Tabla 2

Cepas de B. bassiana
	Testigo	Bb3	Bb4	Bb5	Bb6	Bb17
Mortalidad	1.00 ± 0.81a	1.50 ± 1.73a	5.25 ± 0.95b	2.50 ± 1.00a	2.00 ± 0.81a	2.00 ± 1.41a
Micosis	0.00 ± 0.00 a	0.50 ± 0.57a	2.50 ± 1.29b	1.00 ± 1.15a,b	0.25 ± 0.50a	0.75 ± 0.95a

Dentro de renglones valores con diferente letra difieren significativamente entre sí (P < 0.05). Todos los datos son presentados por media ± DE.

Figura 1

La cepa Bb5 registró (1.00 ± 1.15 escarabajos A. diaperinus con micosis) equivalente al 6.66% (figura 1). Con el valor más bajo en las cepas Bb3 y Bb6 (3.33 y 1.66 % de micosis) respectivamente.

Los resultados mostraron que todos los aislamientos fúngicos fueron patógenos contra escarabajos A. diaperinus, con una mortalidad inducida por micosis del 16.66% como máximo y con diferencias significativas entre cepas (Bb3, Bb4, Bb5, Bb6 y Bb17). Estos resultados son similares a los reportes de (Rohde et al., 2006; Rezende et al., 2009), quienes trabajaron con el mismo escarabajo. Se ha descrito que el primer contacto entre

B. bassiana y A. diaperinus, sucede cuando la espora (conidio) es depositada en la superficie del insecto, de ahí la importancia de la dosis patogénica (1 x 10⁸ conidios/mL) (Santoro et al., 2008).

El conidio inicia el desarrollo de su tubo germinativo y su apresorio para fijarse al escarabajo. Para una germinación adecuada se requiere una HR del 92% y temperatura de entre 23 a 25 °C (Vertyporokh et al., 2019). Después mediante enzimas como las proteasas, lipasas y quitinasas, el hongo entomopatógeno ingresa en A. diaperinus a través de sus partes blandas (Mascarin y Jaronski, 2016).

Dentro del escarabajo, B. bassiana ramifica sus estructuras y coloniza las cavidades del huésped (Daniel et al., 2019). Con toxinas p. ej., beauvericina, beauverolide, bassianolide y oxálico rompe el sistema inmunológico de A. diaperinus, invadiendo todos sus tejidos y matando al escarabajo (Geden y Steinkraus, 2003). Dando así inicio a la fase saprofítica de B. bassiana con su multiplicación y crecimiento (Mascarin y Jaronski, 2016).

Sin embargo, la mayor mortalidad esperada no alcanzó niveles significativos. Daniel et al. (2019) encontraron que los aislados de B. bassiana son altamente virulentos y también indicaron una amplia variabilidad en la virulencia entre cepas (del 2 al 70%). Lo que indica, que al igual que en el presente estudio, es obligatorio evaluar la mayor cantidad posible de cepas y así poder seleccionar la que presente mayor patogenicidad contra A. diaperinus.

Beauveria bassiana demostró ser útil como medida de control biológico para Alphitobius diaperinus de granjas avícolas en el estado de Colima. Se destaca el potencial para causar micosis de la cepa Bb4, sobre las cepas Bb3, Bb5, Bb6 y Bb17 en condiciones de laboratorio. Los resultados encontrados, se podrían utilizar en próximos ensayos para evaluar la cepa Bb4 en condiciones normales dentro de instalaciones para aves.