La abeja Apis mellifera es la principal especie polinizadora empleada por el hombre para aumentar la productividad de los cultivos, y desempeña una importante función en el mantenimiento de la biodiversidad. En los últimos años, el sector apícola se ha visto gravemente amenazado por las pérdidas de colmenas que se han reportado, generando preocupación sobre la diversidad genética de las poblaciones de abejas melíferas (Cobey et al., 2012). Se cree que estas pérdidas son debido a un fenómeno multifactorial, como el cambio climático, los insecticidas, agentes patógenos, las enfermedades virales, entre otros (Tentcheva et al., 2004, van Engelsdorp et al., 2010, Guzmán-Novoa et al., 2010, Neumann y Carreck, 2015).

En este sentido, una de las alternativas para poder preservar las abejas sería la criopreservación de células espermáticas de zánganos en nitrógeno líquido (NL2), para su posterior uso en técnicas de inseminación instrumental. De este modo, se puede conservar el material genético a largo plazo y su disponibilidad de uso puede ser en cualquier época del año (Hopkins y Herr, 2010); sin embargo la criopreservación de células espermáticas de zángano presenta bajos porcentajes de criosuperviviencia (Taylor et al., 2009), afectando negativamente en la producción de crías de reinas inseminadas instrumentalmente, logrando una tasa baja de fertilidad del 47%, con respecto al porcentaje con semen fresco que se encuentra entre un 95- 99% (Hopkins y Herr, 2010). Para minimizar los efectos negativos que se producen durante y después de la criopreservación, se han estudiado diversas soluciones; entre ellos, los crioprotectores como el glicerol, dimetilsulfóxido, etilenglicol y la dimetilformamida; los cuales previenen la formación de cristales de hielo y protegen a los espermatozoides (Nouri et al., 2013, Medeiros et al., 2002). Sin embargo, entre los crioprotectores más utilizados en la congelación de semen de zángano se encuentran el Dimetilsulfóxido (DMSO) y el glicerol. Del mismo modo, se han evaluado infinidad de componentes que se le añaden al diluyente de congelación; entre ellos la leche, glicocola, glicerina, yema de huevo, agua de coco y lecitina de soya. La finalidad de estos componentes es la de preservar las características funcionales de las células espermáticas, mantener el nivel de fertilidad adecuado y protegerlas de las lesiones provocadas por el choque térmico (Stornelli et al., 2005; Dadkhah et al., 2016; Wegener y Bienefeld, 2012).

Actualmente la yema de huevo es uno de los principales componentes más utilizados en la mayoría de los diluyentes de criopreservación de semen en casi todas las especies (Cabrera et al., 2005, Kulaksiz et al., 2010), ya que ejerce un efecto protector sobre las las membranas de los espermatozoides sometidos a procesos de criopreservación (Fernández-Santos et al., 2006; Briand-Amirat et al., 2007). Este efecto de protección se debe al aporte de lipoproteínas de baja densidad (LBD) compuestas por triglicéridos, fosfolípidos y colesterol (Moussa et al., 2002).

Las LBD previenen la formación de cristales de hielo y protege la integridad de la membrana plasmática del choque frío (Hu et al., 2010; Jian-Hong et al., 2011). Asimismo, se ha documentado en diferentes estudios que la eliminación de las lipoproteínas de alta densidad (LAD), mejora la calidad del semen, antes y después de su congelación (Watson y Martin, 1975; Aboagla y Terada, 2004; Fernández-Santos et al., 2006; Briand- Amirat et al., 2007). Debido a esto, se ha recurrido a la centrifugación de la yema de huevo, con la finalidad de eliminar algunos de sus componentes y conservar principalmente las LBD, las cuales han permitido mejorar la congelabilidad del semen de varias especies (Fernández-Santos et al., 2006; Briand-Amirat et al., 2007; Pillet et al., 2011; Nouri et al., 2013). En zánganos, se ha documentado que cuando el diluyente de criopreservación contiene yema de huevo entera, la fertilidad de la reina inseminada se ve afectada con una disminución del número de huevos depositados en las celdas (Hopkins et al., 2011). Asimismo, representa un riesgo para la fertilidad de las abejas reinas inseminadas, ya que las partículas de la yema de huevo pueden obstruir los oviductos de la espermateca y provocar una infección (Hopkins et al., 2012).

Por todo lo anterior expuesto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la yema de huevo entera y centrifugada y sus interacciones con dos tipos de crioprotectores (DMSO y glicerol), sobre la criopreservación del semen de zángano.

Localización y características del área de estudio. La colecta de semen se realizó en el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pesqueras (INIFAP), ubicado en el municipio de Mocochá, Yucatán. Las muestras de semen se evaluaron en el laboratorio del Centro de Selección y Reproducción Ovina (CeSyRO) del Instituto Tecnológico de Conkal.

Captura y manipulación de los zánganos. La captura de los zánganos se realizó mediante rejillas excluidoras, las cuales fueron colocadas frente de la piquera para evitar el ingreso de los zánganos a la colmena y así facilitar su captura. Estas rejillas se colocaron aproximadamente antes del mediodía, debido a que se aseguraba la salida de los zánganos para sus vuelos de rastreo, por lo que la captura se realizó a las 17:00 horas del mismo día, asegurando el regreso de los mismos. La finalidad de esta técnica es obtener individuos adultos de aproximadamente 16 días de vida (zángano maduro). Una vez capturados los zánganos, se colocaban en jaulas transportadoras de 15x15x5 cm; las cuales se llenaban a un 35 % de su capacidad, para que los zánganos pudieran moverse. Posteriormente los zánganos fueron resguardados en colmenas huérfanas, con la finalidad de mantenerlos alimentados durante toda la noche. Al día siguiente los zánganos fueron liberados en jaulas de vuelo de 40x40 cm, durante diez minutos, para alentar la defecación y con ello disminuir la contaminación de las muestras; así como para asegurar el llenado de sus sacos aéreos para obtener una mejor eversión del endófalo (Taylor et al., 2009).

Colecta de semen. Se utilizó la técnica descrita por Laidlaw (1977), que implica forzar de manera manual la eversión parcial y total del endófalo, ejerciendo presión en el tórax y abdomen. Una vez que se detectó el semen en el endófalo, se procedió a su colecta mediante la liberación de una gota de solución salina sobre el semen expuesto y con la ayuda de una jeringa Harbo Schley (ref. 104), y una lupa estereoscópica modelo SMZ zoom Schley (ref. 2.00) y se extrajo el semen. La obtención del semen en todos los zánganos se realizó hasta llenar un tubo capilar con capacidad de 100 µl, para posteriormente ser criopreservado.

Procesamiento de la yema de huevo. Para la obtención de la yema de huevo entera, primero se esterilizó el huevo con alcohol al 70%, después se abrió el huevo cuidadosamente, vertiendo la yema sin romperla en un desyemador, para liberar completamente la yema de la clara. Para eliminar las membranas de la yema, se colocó sobre un papel filtro, haciéndola rodar para retener los restos y así poder extraer con una jeringa la yema de huevo. En el caso de la yema centrifugada, el procedimiento fue el mismo que el de la yema entera, sólo que a 20 ml de yema de huevo entera, se le agregó 20 ml de agua destilada y luego se centrifugó a 10.000 x g/20min, y finalmente se extrajo el sobrenadante de la yema obtenido por centrifugación (LBD), y el pellet que se formó en el fondo del tubo se desechó (LAD).

Diluyentes. Probamos cuatro diluyentes de acuerdo al método descrito por Harbo (1983). Los diluyentes se prepararon con pequeñas modificaciones, por lo que el T1 fue constituido con: 25% de glicerol, 25% de YHC el T2: 25% de DMSO, 25% de YHC, el T3: 25% de glicerol, 25% YHE y el T4: 25% DMSO, 25% YHE. Cada uno de los diluyentes fueron suspendidos con 50% de solución Buffer, con 2.27g p/v de Tris a 375 mm; 0.369g p/v de ácido cítrico a 124 mm, 7.28g p/v de glucosa a 41 mm y 0.025g p/v de estreptomicina, con un pH de 7.0.

Preparación de las muestras. Las muestras de semen fueron diluidas con su respectivo tratamiento a una concentración 3:2. Posteriormente se dejó una alícuota de semen diluido (20 µl), para su evaluación en fresco y el resto se utilizó para su congelación.

Evaluación de la calidad seminal en fresco y descongelado. Las variables que se evaluaron en el semen fresco fueron: la concentración, motilidad, viabilidad e integridad de la membrana espermática. A la descongelación, las variables evaluadas fueron las mismas que en fresco, a excepción de la concentración espermática que no se evaluó.

Concentración espermática. Se estimó mediante la técnica descrita por Taylor et al., (2009), mezclando 2.5 μl de semen puro en 497.5 μl de agua destilada. El número de espermatozoides se observó con una cámara de recuento celular de Buker, y con un microscopio de contraste de fases UOB UB203i a 400x.

Motilidad espermática. Se depositaron 5 µl de semen fresco en un porta objetos en una placa térmica a 37 ºC; se estimó subjetivamente a través de observación visual, examinando al menos 5 campos de cada muestra en un microscopio óptico MO-a 400x a 40x. La valoración se estimó mediante la escala descrita por Locke y Peng (1993), donde: 4 indica más de un 50% de espermatozoides, presentando movimiento circular y movimiento progresivo; 3 indica presencia de movimiento circular y progresivo, y más del 50% con movimiento vibratorio; 2 indica más del 50% con movimiento vibratorio; 1 indica menos del 50% con movimiento vibratorio y 0 sin movimiento.

Viabilidad espermática. Se evaluó de acuerdo a la técnica descrita por Collins y Donoghue, (1999), con las tinciones de fluorescencia Ioduro de propidio y SYBR-14. Se depositó 1μl de cada fluorocromo en 100 μl de cada tratamiento diluido en solución salina (PBS), y se dejaron incubar en la oscuridad durante 5 minutos. Posteriormente se depositó 5 μl de cada muestra teñida sobre un porta objetos y un cubre objetos, para analizar las muestras con un microscopio de fluorescencias. Se analizaron cinco campos y se contaron 100 células, tomando como espermatozoides vivos los teñidos de color verde y los muertos aquellos que presentaban color rojo.

Integridad de la membrana espermática. Se evaluó mediante la técnica descrita por Nur et al. (2012), por lo que se agregó 1.0 μl de semen en 250 μl de agua destilada, seguidamente se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Finalizado el tiempo se colocaron 5 µl de la muestra en un porta objetos y cubre objetos de vidrio para realizar el conteo de 100 espermatozoides, entre los que presentaban colas enrolladas (E+) y no enrolladas (E-).

Criopreservación y descongelación de muestras espermáticas. Todas las muestras espermáticas de los tratamientos fueron envasadas en pajuelas de 0.25 ml y almacenadas en un recipiente con agua a temperatura ambiente (37 ºC). Después el recipiente con las pajuelas se introdujo en un refrigerador durante 50 minutos, provocando de esta forma un descenso gradual de la temperatura a 5 °C/min. Posteriormente las pajuelas fueron colocadas a una distancia de 4 cm de la superficie del nitrógeno líquido durante 20 minutos, para su congelación y almacenamiento en NL2 (Taylor et al., 2009). Las muestras espermáticas fueron descongeladas mediante su inmersión en agua a 25 ºC durante 60 segundos (Taylor et al., 2009).

Análisis estadístico. Debido a que las variables mostraron parametricidad, se procedió a realizar un ANDEVA y posteriormente una prueba de Tukey para determinar las diferencias de medias; para ello se utilizó el Software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión 20.0 (SPSS, 2011).

En el semen fresco diluido, el T1 fue el que mejor preservó la motilidad, presentando un 50% de espermatozoides móviles circulares y movimientos progresivos (grado 4); después le siguió el T2 y T3, con movimientos circulares y progresivos, y más de un 50% de movimientos vibratorio (grado 3); y el T4 que fue el que presentó menos de 50% de movimientos vibratorio (grado 1). Se observó diferencia entre el T4 y los demás tratamientos (p< 0.05) (tabla 1). Estos resultados son similares a los reportados por Lensky y Schindler (1967) con semen fresco de zángano.

Tabla 1

Tratamiento	Motilidad (0 a 4)	Viabilidad (%)	Host (%)
YHC + glicerol (T1)	4.00 ± 0.00 a	95.75 ± 1.20 a	89.75 ± 0.42 a
YHC + DMSO (T2)	2.33 ± 0.21 b	82.75 ± 1.93 b	80.12 ± 0.29 b
YHE + glicerol (T3)	2.67 ± 0.21 b	93.58 ± 0.57 a	84.00 ± 1.08 b
YHE + DMSO (T4)	2.00 ± 0.00 b	38.83 ± 3.00 c	75.65 ± 0.25 c

YHC: Yema de huevo centrifugada; YHE: Yema de huevo entera; DMSO: dimetilsulfóxido a, b diferentes literales por columna indican una diferencia estadística significativa (p< 0.05).

En el semen descongelado se observó que el T2 y T3 fueron los que obtuvieron una mayor motilidad, con más del 50% de movimientos vibratorios (grado 2); mientras que el T1 y T4 (p> 0.05) fueron los que presentaron más baja motilidad con menos de 50 % de movimientos (grado1) (tabla 2). Se observó una reducción significativa de la motilidad antes y después del proceso de congelación (p< 0.05). Estos parámetros evaluados son difíciles de comparar con otros estudios, puesto que sólo describen la presencia o ausencia de movimiento, y no mencionan el tipo de movimiento (Hopkins y Herr, 2010; Taylor et al., 2009).

Tabla 2

Tratamiento	Motilidad (0 a 4)	Viabilidad (%)	Host (%)
YHC + glicerol (T1)	1.36 ± 0.12 a	44.40 ± 0.66 a	82.75 ± 0.71 a
YHC + DMSO (T2)	1.83 ± 0.11 b	59.10 ± 1.44 a	84.35 ± 0.72 a
YHE + glicerol (T3)	2.13 ± 0.17 b	55.90 ± 0.98 a	83.25 ± 0.11 a
YHE + DMSO (T4)	1.06 ± 0.45 a	33.65 ± 0.73 b	72.50 ± 0.73 b

YHC: Yema de huevo centrifugada; YHE: Yema de huevo entera; DMSO: dimetilsulfóxido a, b diferentes literales por columna indican una diferencia estadística significativa (p< 0.05).

Al parecer la yema de huevo entera o centrifugada y su interacción con el glicerol o DMSO, si actúan de manera diferente sobre la protección de los espermatozoides de zángano que se someten a congelación; por lo que es necesario encontrar el mejor diluyente que conserve o mejore la motilidad de los espermatozoides después de la criopreservación, ya que juega un papel importante en la migración de los espermatozoides a los oviductos laterales de la espermateca (Collins, 2000), e incluso se ha descrito que el movimiento flagelar de los espermatozoides puede aumentar la reproductividad de las reinas inseminadas (Tofilski, 2014). Normalmente la producción de crías obreras en abejas reina inseminadas con semen fresco es aproximadamente de 95 a 99%, mientras que con semen descongelado se producen menos del 50% de abejas obreras; observándose un mayor número de zánganos emergidos (huevos no fertilizados) (Hopkins et al., 2012).

La viabilidad espermática del semen fresco diluido fue mayor en el T1 (95.75 ± 1.20) en comparación con el T3 (93.58% ± 0.57), el T2 (82.75 ± 1.93) y el T4 (38.83 ± 3.00). No se encontraron diferencias entre el T1 y T3 (p> 0.05) (Figura 2). Estos resultados son similares a los reportados por Nur et al. (2012), Collins y Pettis (2001) y Collins (2004) en semen fresco de zángano.

A la descongelación, la viabilidad fue mayor en el T2 (59.10% ± 1.44) en comparación con el T3 (55.90% ± 0.98), el T1 (44.40% ± 0.66) y el T4 (33.65% ± 0.73). No se encontraron diferencias entre el T1 y el T3 (p> 0.05), ni tampoco entre el T2 y el T3 (p> 0.05) (tabla 2). Se observó una reducción significativa de la viabilidad de los espermatozoides antes y después del proceso de congelación (p< 0.05). Estos resultados obtenidos son inferiores a los reportados pos descongelación por Nur et al. (2012) con un 87.2% y Taylor et al. (2009) con un 68.3%.

La integridad de la membrana espermática en las muestras de semen fresco diluido fue mayor en el T1 (89.75% ± 0.42), en comparación con el T3 (84.00% ± 1.08), el T2 (80.12 ± 0.29) y el T4 (75.65 ± 0.25). Únicamente el T4 tuvo diferencias con los demás tratamientos (p< 0.05) (tabla 1). Los resultados son similares reportados por Nur et al. (2012) con un 92.2%.

A la descongelación se presentó una mayor integridad de la membrana espermática, en las muestras donde se adicionó el T2 (84.35% ± 0.72); en comparación con el T3 (83.25% ± 0.11), el T1 (82.75% ± 0.71) y con el T4 (72.50% ± 0.73). No se encontraron diferencias entre el T1, T2 y T3 (p> 0.05) (tabla 2). No se encontraron diferencias en la reducción de la integridad de la membrana espermática, antes y después del proceso de congelación (p> 0.05). Se pudo observar que las membranas de la cola de los espermatozoides de zángano son muy resistentes al proceso de congelación-descongelación; esto pudo ser debido a que las membranas celulares los espermatozoides de zángano, responden bien a la regulación de los cambios osmóticos durante la congelación y descongelación celular, permitiendo el ingreso de los crioprotectores a las membranas y la expulsión del agua (Karger et al., 2016; Watson, 2000).

Con base a los resultados obtenidos en este estudio, se concluye que el diluyente a base de YHC + glicerol (T1) es el más idóneo para criopreservar muestras espermáticas de zángano.