El medio de cultivo utilizado fue Woody Plant Medium (WPM/50) (Trigiano and Gray, 2011); este medio se utilizó a la mitad de su concentración, constituido principalmente de sales minerales y vitaminas, tales como: tiamina, mio-inositol, sacarosa y agar. La fitohormona que se utilizó fue: ácido indolbutírico, a concentraciones de 0, 0.5, 1.0,1.5 y 2.0 mgL^-1. No se aplicó antioxidantes al medio.

La cámara de flujo laminar (Marca Edge Gard Hood), se desinfectó previamente antes de realizar los cultivos, utilizando alcohol al 99% y vickor, y posteriormente durante 30 min se dejó encendida una lámpara de luz fluorescente de 40 W, la cual proporcionó una irradiación de 8-10 W. m-². Se utilizaron tubos de ensayo y frascos tipo gérber de vidrio transparente. También se utilizaron cajas Petri de vidrio, pinzas y bisturí; todo el material fue previamente esterilizado en una autoclave modelo Sterilmatic, a una temperatura de 120° C y 15 kg/cm² de presión durante 15 minutos.

Las semillas fueron previamente embebidas con agua desionizada, durante 2 horas antes de la siembra. Los explantes (hojas tallos, yemas axilares, apicales y semillas sin pericarpio, fueron embebidas durante 3 horas en agua desionizada), después se desinfectaron con alcohol etílico al 70% durante 3 minutos; y posteriormente en hipoclorito de sodio (NaClO) (CLOROX®) al 15% durante 12 min, añadiendo una gota de tween 20; se realizaron 3 enjuagues con agua desionizada. Posteriormente se colocaron en una solución antioxidante de ácido ascórbico (150 mg/L) y ácido cítrico (100 mg/L) durante 5 minutos, y posteriormente se sembraron.

Para la siembra se utilizaron frascos de vidrio tipo gérber. Los explantes fueron previamente sembrados; posteriormente se colocaron el cuarto de incubación, en condiciones controladas, manteniendo una temperatura de 25 ± I^o C, y un fotoperiodo de 16 horas luz con 8 horas de oscuridad y 70-75% de humedad relativa.

La evaluación se realizó por observación y medición en los diferentes explantes, iniciándose al tercer día de su incubación y posteriormente se observaron y se realizaron mediciones cada siete días durante 2 meses.

Los parámetros evaluados fueron:

Porciento de germinación (%), utilizándose el criterio de la ISTA (2019).

El diseño experimental que se utilizó en este trabajo de investigación fue completamente aleatorizado, con un arreglo factorial de 5x3 (5 concentraciones y 3 explantes), con 10 repeticiones. Se realizó un análisis de varianza (ANDEVA), con un nivel de significancia de P<0.05, y una comparación de medias de Tukey. Para el análisis de los datos se empleó el paquete estadístico JMP, versión 9.0.1 (Statistical Analysis System, [SAS Institute Inc.], 2011).

La germinación in vitro inició el 4^to y concluyo al 15^to día. No se presentaron diferencias significativas en el porcentaje de germinación, entre tratamientos de AIB utilizadas en este estudio, presentado un porcentaje de germinación 79.0 a 83.0%; estos resultados nos indican que para la germinación de la semilla de Krameria erecta no se requiere el uso de ningún tipo de fitohormona, en el medio de cultivo; al no ser significativo su porcentaje de germinación, ver tabla 1 y figura 1.

Tabla 1

Tratamiento AIB mgL-1	Semillas germinadas (%)	Plántulas Normales (%)	Plántulas anormales (%)	No germinadas (%)	Plántulas Altura (cm)
0	82.75±1.49a	71 25±a	11.50±1.29b	8.50±1.00a	10.07±0.21b
0.5	81.50±1.49a	31,25±b	50.25±2.75a	9.75±0.50a	10.42±0.21b
1.0	83.00±1.49a	32.00±b	51.00±2.44a	9.75±0.95a	10.52±0.21b
1.5	79.00±1.49a	31,75±b	49.75±2.50a	10.50±1.29a	11,65±0.21a
2.0	82.00±1.49a	31,50±b	50.50±3.10a	10.25±0.95a	11.60±0.21a

Medias con letras iguales dentro de la misma columna indican que no hay diferencias significativas (P<0.05). Los datos presentados son la media de 10 repeticiones con 3 muestras cada frasco por tratamiento.

Figura 1

Con respecto al porcentaje de plántulas normales germinadas, se presentó diferencias significativas (P ≤0.05), entre las concentraciones de AIB (0.5, 1.0, 1.5 y 2 mgL^-1), con respecto al control (sin fitohormona); presentándose para el control un 71.25% de plántulas normales, y entre un 31.25 a 32.0% con el uso de AIB, ver tabla 1. Cabe mencionar que también se observaron diferencias significativas (P≤0.05), al evaluar el porcentaje de plántulas anormales de krameria erecta, con respecto a los tratamientos, presentando de un 11.5% de plántulas anormales en el control; mientras que en los tratamientos con AIB se presentaron de 49.75 a 51.0% de plántulas anormales.

Al analizar el porcentaje de semillas no germinadas, no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos presentándose de 8.5 a 10.5% de semillas que no germinaron, ver tabla 1. Dichos resultados muestran que el uso de auxinas estimuló en la germinación geotropismo negativo, al presentarse arriba del 50% de plántulas anormales.

Golubov et al, (2007), menciona que la germinación está ligada al crecimiento del embrión. La germinación de plántulas normales fue menor del 32.00%, al presentarse una radícula bien definida y la brotación de sus hojas seminales. De acuerdo a la AOSA (2005), indica que las plántulas que presentaron un crecimiento anormal no se desarrollan, al presentar deficiencias en su sistema radicular (falta de radícula, fototropismo negativo u otras malformaciones).

El porcentaje de germinación en Krameria erecta fue similar a los obtenidos por Golubov et al., (2007), obtuvieron porcentajes de germinación in vitro mayores al 80% en semillas de B. recúrvala, que fueron almacenadas (en deshidratación con silica gel), durante seis años, a 6^o C, con humedad relativa baja.

La altura de las plántulas de krameria erecta, presentaron diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre los tratamientos evaluados, ver tabla 1. Las plántulas con los tratamientos de 1.5 a 2.0 mgL^-1 de AIB presentaron 11.60 a 11.66 cm de altura, sin tener entre estas diferencias significativas; mientras que 0, 0.5 y 1.0 mgL^-1 de AIB, no presentaron diferencias significativas, mostrando 10.07 a 10.52 cm. Las plántulas presentaron características propias y morfológicamente similares a las plantas presentes en su hábitad silvestre.

De acuerdo a los explantes utilizados en esta investigación, se mostró que existen diferencias significativas (P ≤ 0.05) con respecto a la altura de los callos, de 0.58 a 0.67 mm de alto, ver tabla 2 y figura 2; excepto el tratamiento de cero mgL^-1 de AIB (control), no presentó callo. En lo que respecta a lo ancho del callo, también se presentaron diferencias significativas (P≤0.05), de acuerdo al análisis estadístico, indicando de 0.76 a 0.96 mm en los tratamientos de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mgL^-1 de AIB.

Tabla 2

Tratamiento AIB mgL1	Altura callo (mm)		Ancho callo (mm)		Numero de raíz
	Hoja	Yema axilar	Hoja	Yema axilar	Hoja	Yema axilar
0	0.00±0.00d	0.00±0.00c	0.00±0.00d	0.00±0.00c	0.00±0.00c	0.00±0.00a
0.5	0.58±0.00c	0.45±0.00b	0.76±0.01c	0.56±0.01b	0.50±0.57b	0.00±0.00a
1.0	0.65±0.01b	0.46±0.00a	0.86±0.02b	0.58±0.00a	1.25±0.95b	0.00±0.00a
1.5	0.67±0.00a	0.47±0.00a	0.96±0.03a	0.59±0.00a	2.50±0.57a	0.00±0.00a
2.0	0.67±0.00a	0.47±0.00a	0.93±0.03a	0.59±0.00a	2.00±0.81a	0.00±0.00a

Medias con letras iguales dentro de la misma columna indican que no hay diferencias significativas (P<0.05). Los datos presentados son la media de 10 repeticiones con 3 muestras cada frasco por tratamiento.

Figura 2

En yema axilar se presentaron diferencias significativas (P≤0.05) entre los tratamientos, excepto en 1.5 y 2.0 mgL^-1 de AIB; presentando alturas en yemas de 0.93 a 0.96 mm. En lo que respecta a lo ancho del callo en yema axilar, se presentaron diferencias significativas (P≤0.05) entre los tratamientos de 1.0, 1.5 y 2.0 mgL^-1 de AIB, con respecto a 0.5 y 0 mgL^-1 de AIB. El tratamiento de cero mgL^-1 de AIB (control) no presentó callo, ver tabla 2. A pesar de la diferencia significativa que existen entre los tratamientos, cabe mencionar que la aplicación de auxina (AIB) es eficaz para la inducción de callo en hoja y en yema axilar de cosahui del sur ( Krameriaerecta), presentado un color inicial blanco y tornarse a verde claro, con una consistencia firme; por lo tanto, podemos señalar que los callos son viables para la inducción de ser un callo embriogénico.

El porcentaje con relación a la presencia de callo en los explantes, en las hojas se presentaron hasta un 80%; mientras que en el control presentó 0%. El crecimiento de los callos se presentó a los 30 días de la incubación y su proliferación a las cuatro semanas de incubación. El porcentaje presente de callos en yemas axilares fue hasta un 60%, excepto el control que no presentó. La inducción de callo en yemas axilares se presentó a las 6 semanas de incubación.

Los resultados indican que la mejor respuesta de inducción de callos en hojas o en yemas axilares se presentó al aplicar la concentración de 1.0 a 2.0. Es importante señalar que el explante ideal para la producción de callo fueron las hojas, de acuerdo al análisis estadístico aplicado.

Para el crecimiento celular las auxinas deben pr evocar dicha inducción de acuerdo a los genes que codifican los factores proteicos (Córdova et al., 2014); de esta manera las células se dilatan por la presión del agua en el interior de la vacuola, para seguir creciendo hasta que exista una resistencia de la pared celular (Azcon-Bieto y Talón 2008).

De acuerdo a Smith y Atkins (2002); Arellano et al., (2008), la inducción de callo se presenta al momento que las células crecen y almacenan nutrientes, y con la presencia de auxinas y las citosinas provocan que se acumulen y estimulan las ciclinas a nivel transcripcional, desencadenando la activación de las quinasas; y asimismo promover el nuevo ciclo celular y formación de callo. La inducción de callo es independiente del tipo de explante y fitohormona utilizada (Howell et al., 2003; Shiram et al., 2008; Rodríguez et al., 2014).

En este estudio se logró producción de callogénesis con el uso de auxinas en yemas axilares y hojas de krameria erecta; por lo tanto, existe una estimulación en la mitosis, promoviendo la formación de tejido calloso (Smith 2012).

En cuanto al número de raíz presente en las hojas, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos, mostrando raíces en las connotaciones de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mgL-¹ de AIB, excepto en el tratamiento cero mgL-¹ de AIB (control), quien tuvo nula inducción de raíz. Mientras que en yema axilar no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos (0, 0.5, 1.0,1.5 y 2.0 mgL^-1 de AIB), al no presentarse raíces, ver tabla 2. El porcentaje de raíz presente en hoja fue del 30%, mostrándose en hojas con presencia de callo.

Hasta hoy en día no existen trabajos referentes a este arbusto u otros arbustos, por lo tanto, se complica la discusión de la información por la escasa información que se recopiló; más sin embargo, se cuenta con otros estudios de otras especies y géneros diferentes, como Oryza sativa (Pérez et al., 2009) y Eucaiyptus giobuius (Gómez et al.,2006), etc. Con el método de cultivo in vitro, es posible obtener plantas de calidad uniforme, de acuerdo a un genotipo seleccionado (Levitus et al., 2010). Las fitohormonas

no son especializadas para inducir mutaciones, ya que en concentraciones altas acelera los procesos de división celular, y posiblemente genere variaciones genéticas (Georgeal., 2008).

Los explantes, por su procedencia (área silvestre) traen algunos fitopatógenos, los cuales pueden causar problemas al momento de su siembra y desarrollarse para su proliferación. La contaminación se presentó básicamente en todas las concentraciones y explantes utilizados. Se presentaron bacterias y hongos ambientales (bióticos y abióticos), indicándose esta contaminación a partir del tercer día de incubación. Al analizar el porciento de contaminación presente en las semillas de Krameria erecta, de acuerdo a la concentración y tiempo de remojo que se manejó en esta investigación, no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados, al presentarse una tasa de contaminación de 7.25 a 8.75%.

Es importante señalar que las plántulas desarrolladas In vitro estuvieron libres de contaminación por más de 3 meses; por lo tanto, el método de desinfección en semillas de Krameria erecta fue adecuado. Tampoco se presentaron diferencias significativas en cuando a la contaminación presente en los explantes de yema axilar y hoja, mostrando de 11.25 a 12.50% de contaminación, ver tabla 3. Podemos señalar que fue efectivo el tratamiento de desinfección de los explantes, al utilizar etanol al 70% por 3 minutos, y posteriormente por 12 minutos en hipoclorito de sodio comercial al 15%. La muerte de microorganismos es debido a la combinación del hipoclorito de sodio con las proteínas de las membranas celulares y las enzimas (Flores et al., 2008).

Tabla 3.

Tratamiento AIB mgL-1	Contaminación (%)			Oxidación (%)
	Semillas	Hojas	Yema apical	Semillas	Hoja	Yema apical
0	8.75±1.08a	11.25±2.50a	11,25±2.50a	0.00±0.00a	28.7±2.5a	26.2±7.50a
0.5	8.75±1,08a	12.50±2.88a	12.50±2.88a	0.00±0.00a	28.7±4.7a	30.0±7.07a
1.0	7.25±1,08a	11,25±2.50a	11.25±2.50a	0.00±0.00a	28.7±2.5a	26.2±7.50a
1.5	8.00±1.08a	11.25±2.50a	12.50±2.88a	0.00±0.00a	30.0±4.0a	26.2±7.50a
2.0	7.75±1.08a	11.25±2.50a	12.50±2.88a	0.00±0.00a	28.7±2.5a	26.2±7.50a

Medias con letras iguales dentro de la misma columna indican que no hay diferencias significativas (P<0.05). Los datos presentados son la media de 10 repeticiones con 3 muestras cada frasco por tratamiento.

La etapa fisiológica del tejido vegetal tiene gran influencia en el proceso de desinfección. El material de plantas en crecimiento se desinfecta más fácil que el de plantas maduras; sus depósitos de ceras y ligninas son mayores y son una barrera para la acción del agente desinfectante sobre los microorganismos endógenos (López et al., 2010; Pedroza et al.,2007). Entre los contaminantes más comunes in vitro son las bacterias, éstas son difíciles de detectar y originan serios problemas (Orlikowska et al., 2017). Muchos microorganismos necesitan un tiempo de adaptación a las nuevas condiciones, previamente al manifestar su presencia, esto ocurre generalmente en la fase de multiplicación (Hernández y González, 2010).

En lo que respecta a la tasa de oxidación (oscurecimiento), en los explantes de manera general, no se presentaron diferencias significativas al analizar esta variable en los diferentes explantes (yema axilar y hoja), mostrando en hojas un 28.7 a 30.0% de oxidación; mientras que en yema axilar se presentó un 26.2 a 30.0%. En lo que respecta a las semillas, éstas no presentaron oxidación, ver tabla 3. De acuerdo al bajo porcentaje de oxidación presente, se puede atribuir a la mezcla de antioxidantes utilizados (ácido ascórbico + ácido cítrico). En este trabajo se obtuvieron resultados favorables.

De acuerdo a Vatanpour-Azghandi et al., (2002); Tang y Newton, (2004); Gratao et al., (2005); Pompeu et al., (2008), la enzima y el sustrato al estar en contacto con la célula se presenta un daño, estrés o de senescencia, dando como resultado la muerte de las células del explante. Existen algunos factores o sustancias que pueden desencadenar el estrés oxidativo y nitrosativo, tales como: intensidad de luz, cortes, herbicidas, senescencia, patógenos, metales pesados, lesiones o sustancias abrasivas (Mittler et al.,2004; Pompeu et al., 2008). Los explantes de especies leñosas presentan esta reacción de oxidación Azofeifa (2009).

En cultivo de tejidos in vitro, la oxidación es causada principalmente por el agente desinfectante durante la asepsia del explante, los cortes, composición del medio de cultivo, volumen y calidad del frasco de cultivo (Tabiyeh et al., 2006; Van Staden et al.,2006; Abdelwahd et al., 2008). El oscurecimiento de explantes o estrés oxidativo se ha relacionado con otros desordenes fisiológicos, morfológicos, epigenéticos y genéticos, que presentan los explantes cultivados, tales como recalcitrancia, hiperhidricidad, variación somaclonal y habituación (Cassells y Curry 2001; Van Staden et al., 2006).

Por lo tanto, podemos señalar que la oxidación en los explantes de K. erecta utilizados en este estudio, pudo presentarse por diversos factores, como los antes mencionados; como también por el tiempo de exposición a la temperatura presente en la cámara de flujo.